Segurança Alimentar Desde 2004 a tratar da Segurança Alimentar em Portugal
Decreto-Lei n.º 27-A/2006
PÁGINAS DO DR : 1100-(2) a 1100-(239)
O Decreto-Lei n.º 82/95, de 22 de Abril, aprovou os princípios gerais do regime jurídico da notificação de substâncias químicas e da classificação, embalagem e rotulagem de substâncias perigosas para a saúde humana ou para o ambiente. Posteriormente, em sua regulamentação, a Portaria n.º 732-A/96, de 11 de Dezembro, aprovou o Regulamento para a Notificação de Substâncias Químicas e para a Classificação, Embalagem e Rotulagem de Substâncias Perigosas, completando, assim, o processo de transposição para a ordem interna das directivas comunitárias então aplicáveis neste domínio.
Em virtude das novas exigências de adaptação ao progresso científico e técnico emergentes da necessidade de transposição das directivas comunitárias entretanto publicadas, a referida portaria foi, posteriormente, alterada pelo Decreto-Lei n.º 330-A/98, de 2 de Novembro, rectificado pela Declaração de Rectificação n.º 3-E/99, de 30 de Janeiro, e pelos Decretos-Leis n.os 209/99, de 11 de Junho, 195-A/2000, de 22 de Agosto, 222/2001, de 8 de Agosto, 154-A/2002, de 11 de Junho, e 72-M/2003, de 14 de Abril.
O constante progresso dos conhecimentos científicos e técnicos que se verifica neste campo determina uma constante mutação e actualização da normação comunitária sobre esta matéria, no que deve ser acompanhada de perto pelo legislador nacional. Nesse contexto, tendo sido transpostas para o direito interno todas as directivas comunitárias decorrentes da Directiva n.º 67/548/CEE, do Conselho, importa agora transpor a Directiva n.º 2004/73/CE, de 29 de Abril, rectificada em 16 de Junho e em 7 de Julho de 2004, a qual constitui a 29.ª adaptação ao progresso técnico daquela directiva.
Foi consultado o Instituto do Consumidor.
Assim:
Nos termos da alínea a) do n.º 1 do artigo 198.º da Constituição, o Governo decreta o seguinte:
Artigo 1.º
Objecto
O presente diploma altera o Regulamento para a Notificação de Substâncias Químicas e para a Classificação, Embalagem e Rotulagem de Substâncias Perigosas, aprovado pela Portaria n.º 732-A/96, de 11 de Dezembro, com a redacção dada pelos Decretos-Leis n.os 330-A/98, de 2 de Novembro, 209/99, de 11 de Junho, 195-A/2000, de 22 de Agosto, 222/2001, de 8 de Agosto, 154-A/2002, de 11 de Junho, e 72-M/2003, de 14 de Abril, transpondo para a ordem jurídica nacional a Directiva n.º 2004/73/CE, de 29 de Abril, com a redacção dada pelas rectificações de 16 de Junho e 7 de Julho de 2004, que altera e adapta ao progresso técnico, pela 29.ª vez, a Directiva n.º 67/548/CEE, do Conselho, de 27 de Junho.
Artigo 2.º
Alteração ao anexo I do Regulamento para a Notificação de Substâncias Químicas e para a Classificação, Embalagem e Rotulagem de Substâncias Perigosas.
O anexo I do Regulamento para a Notificação de Substâncias Químicas e para a Classificação, Embalagem e Rotulagem de Substâncias Perigosas é alterado nos termos seguintes:
a) A nota K do seu preâmbulo passa a ter a redacção constante do anexo I ao presente diploma, do qual faz parte integrante;
b) São substituídas as suas entradas pelas entradas com idêntico número de índice constantes do anexo II ao presente diploma, do qual faz parte integrante;
c) A entrada com o número de índice 048-002-00-0 é substituída pelas entradas com os números de índice 048-002-00-0 e 048-011-00-X constantes do anexo III ao presente diploma, do qual faz parte integrante;
d) A entrada com o número de índice 609-006-00-3 é substituída pelas entradas com os números de índice 609-006-00-3 e 609-065-00-5 constantes do anexo III ao presente diploma;
e) A entrada com o número de índice 612-039-00-6 é substituída pelas entradas com os números de índice 612-039-00-6 e 612-207-00-9 constantes do anexo III ao presente diploma;
f) São eliminadas as entradas com os números de índice 604-050-00-X, 607-050-00-8, 607-171-00-6 e 613-130-00-3.
Artigo 3.º
Aditamento ao anexo I do Regulamento para a Notificação de Substâncias Químicas e para a Classificação, Embalagem e Rotulagem de Substâncias Perigosas.
São aditadas ao anexo I do Regulamento para a Notificação de Substâncias Químicas e para a Classificação, Embalagem e Rotulagem de Substâncias Perigosas as entradas constantes do anexo IV ao presente diploma, do qual faz parte integrante.
Artigo 4.º
Alteração ao anexo V do Regulamento para a Notificação de Substâncias Químicas e para a Classificação, Embalagem e Rotulagem de Substâncias Perigosas.
O anexo V do Regulamento para a Notificação de Substâncias Químicas e para a Classificação, Embalagem e Rotulagem de Substâncias Perigosas é alterado nos termos seguintes:
a) O capítulo B.1-bis é substituído pelo anexo V ao presente diploma, do qual faz parte integrante;
b) O capítulo B.1-tris é substituído pelo anexo VI ao presente diploma, do qual faz parte integrante;
c) O capítulo B.4 é substituído pelo anexo VII ao presente diploma, do qual faz parte integrante;
d) O capítulo B.5 é substituído pelo anexo VIII ao presente diploma, do qual faz parte integrante;
e) O capítulo B.31 é substituído pelo anexo IX ao presente diploma, do qual faz parte integrante;
f) O capítulo B.35 é substituído pelo anexo X ao presente diploma, do qual faz parte integrante.
Artigo 5.º
Aditamento ao anexo V do Regulamento para a Notificação de Substâncias Químicas e para a Classificação, Embalagem e Rotulagem de Substâncias Perigosas.
São aditados ao anexo V do Regulamento para a Notificação de Substâncias Químicas e para a Classificação, Embalagem e Rotulagem de Substâncias Perigosas:
a) O capítulo A.21, nos termos do anexo XI ao presente diploma, do qual faz parte integrante;
b) Os capítulos B.42 e B.43, nos termos do anexo XII ao presente diploma, do qual faz parte integrante;
c) Os capítulos C.21 a C.24, nos termos do anexo XIII ao presente diploma, do qual faz parte integrante.
Visto e aprovado em Conselho de Ministros de 26 de Outubro de 2005. – José Sócrates Carvalho Pinto de Sousa – António Luís Santos Costa – Diogo Pinto de Freitas do Amaral – Francisco Carlos da Graça Nunes Correia – António Fernando Correia de Campos.
Promulgado em 9 de Dezembro de 2005.
Publique-se.
O Presidente da República, JORGE SAMPAIO.
Referendado em 15 de Dezembro de 2005.
O Primeiro-Ministro, José Sócrates Carvalho Pinto de Sousa.
ANEXO I
Nota K. – Não é necessário classificar a substância como cancerígena ou mutagénica se for possível provar que a substância contém menos de 0,1% m/m, de 1,3-butadieno (número EINECS 203-450-8). Se a substância não for classificada como cancerígena ou mutagénica, devem ser aplicadas pelo menos as frases «S» (2-)9-16. A presente nota aplica-se apenas a determinadas substâncias complexas do anexo I derivadas do petróleo.
ANEXO II
(ver quadro no documento original)
ANEXO III
(ver quadro no documento original)
ANEXO IV
(ver quadro no documento original)
ANEXO V
“B.1 bis. TOXICIDADE ORAL AGUDA – PROCEDIMENTO DE DOSE FIXA
1. MÉTODO
O presente método é equivalente ao “Test Guideline” TG 420 da OCDE (2001)
1.1 INTRODUÇÃO
Os métodos tradicionais de avaliação de toxicidade aguda utilizam a morte dos animais como critério específico. Em 1984, foi sugerida pela British Toxicology Society uma nova abordagem ao ensaio da toxicidade aguda com base na administração de uma série de doses fixas (1). Esta abordagem evitava a utilização da morte dos animais como um critério específico. O novo método baseava-se na observação de sinais evidentes de toxicidade ocorrentes a determinado valor de uma série de doses fixas. Em 1992 e no seguimento dos estudos de validação in vivo efectuados tanto no Reino Unido (2) como internacionais (3), o procedimento foi adoptado como método de ensaio. Subsequentemente, as propriedades estatísticas do Procedimento de Dose Fixa foram avaliadas em vários estudos utilizando modelos matemáticos (4)(5)(6). Em conjunto os estudos in vivo e de modelação mostraram que o procedimento é reprodutível, utiliza um menor número de animais e causa menor sofrimento do que os métodos tradicionais, permitindo classificar as substâncias de um modo semelhante a outros métodos de ensaio de toxicidade aguda.
No Documento de Orientação sobre Ensaios de Toxicidade Oral Aguda (7) podem consultar-se as orientações sobre a selecção do método de ensaio mais apropriado a determinado fim. Este Documento de Orientação contém igualmente informação adicional sobre o procedimento e interpretação do Método de Ensaio B.1.
Um dos princípios básicos do presente método consiste na utilização de doses moderadamente tóxicas no estudo principal, evitando a administração de doses previsivelmente letais. Além disso, não é necessário administrar doses para as quais se sabe previamente que causam dor e sofrimento óbvios, devido à sua acção corrosiva ou fortemente irritante. Os animais moribundos ou os animais que apresentam sinais óbvios de dor ou sofrimento grave e continuado devem ser sacrificados sem dor e, na interpretação dos resultados do ensaio, devem ser considerados do mesmo modo que os animais que morrem durante o ensaio. Os critérios sobre a decisão de sacrificar animais moribundos ou em sofrimento grave, bem como as orientações sobre a identificação de morte previsível ou iminente, estão incluídos separadamente num Documento de Orientação (8).
O presente método permite obter informação sobre a perigosidade e possibilita a graduação e classificação da substância em conformidade com o Sistema Harmonizado ao Nível Mundial (GHS) para a classificação de substâncias químicas que causam toxicidade aguda (9).
Antes de efectuar o estudo, o laboratório de ensaio deve ter em conta toda a informação disponível sobre a substância de ensaio. Esta informação incluirá a identificação e a estrutura química da substância, as suas propriedades físico-químicas, os resultados de quaisquer outros ensaios de toxicidade da substância in vitro ou in vivo, dados toxicológicos sobre substâncias estruturalmente semelhantes e a(s) utilização(ões) prevista(s) para a substância. Esta informação é necessária para satisfazer todos os envolvidos em relação à relevância do ensaio ao nível da protecção da saúde humana e será útil na determinação de uma dose inicial apropriada.
1.2 DEFINIÇÕES
Toxicidade oral aguda: refere-se ao conjunto de efeitos adversos que se manifestam após a administração oral de uma dose única da substância ou de várias doses num período de 24 horas.
Morte retardada: significa que o animal não morre nem aparenta estar moribundo num período de 48 horas, mas morre mais tarde, no decorrer do período de observação de 14 dias.
Dose: quantidade aplicada da substância de ensaio. O valor da dose é expresso em peso de substância de ensaio por unidade de peso do animal (mg/kg).
Toxicidade evidente: termo geral que descreve a ocorrência de sinais óbvios de toxicidade na sequência da administração da substância de ensaio (consultar os exemplos descritos em [3]) no qual a dose fixa mais elevada seguinte pode induzir, na maior parte dos animais, dor intensa, sinais persistentes de distúrbios graves, estado moribundo (os respectivos critérios são apresentados no Documento de Orientação de Critérios Específicos sem Dor (8) ou, provavelmente, mortalidade.
GHS: Sistema Harmonizado ao Nível Mundial (Globally Harmonised System) para a Classificação de Substâncias Químicas e Misturas. Trata-se de um trabalho conjunto da OCDE (saúde humana e ambiente), do Comité de Peritos em Transporte de Mercadorias Perigosas das Nações Unidas (propriedades físico-químicas) e da OIT (notificação de perigos) e coordenado pelo Programa Interorganizações para a Boa Gestão das Substâncias Químicas (Interorganisation Programme for the Sound Management of Chemicals [IOMC]).
Morte iminente: situação em que se prevê a ocorrência de estado moribundo ou morte antes da próxima observação planeada. Alguns dos sinais indicativos deste estado em roedores incluem convulsões, posição lateral, posição deitada e tremores. (Consultar o Documento de Orientação de Critérios Específicos sem Crueldade [8] para mais detalhes.)
DL(índice 50) (Dose Letal Média): dose única, calculada estatisticamente, de uma substância susceptível de causar a morte de 50% dos animais quando administrada por via oral. O valor da DL(índice 50) é expresso em peso, de substância de ensaio, por unidade de peso do animal de ensaio (mg/kg).
Teste-limite refere-se a uma dose com o valor limite superior admitido pelo ensaio (2000 ou 5000 mg/kg).
Estado moribundo: encontrar-se num estado de morte ou de incapacidade de sobrevivência, mesmo com tratamento. (Consultar o Documento de Orientação de Critérios Específicos sem Dor[8] para mais detalhes.)
Morte previsível: presença de sinais clínicos indicativos de ocorrência de morte em determinada altura (antes do final planeado da experiência, por exemplo): incapacidade de alcançar água ou comida. (Consultar o Documento de Orientação de Critérios Específicos sem Dor [8] para mais detalhes.)
1.3 PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO
São administradas doses gradualmente crescentes a grupos de animais do mesmo sexo, usando as doses fixas de 5, 50, 300 e 2000 mg/kg (excepcionalmente pode utilizar-se uma dose fixa adicional de 5000 mg/kg; consultar a secção 1.6.2). A dose inicial é escolhida com base num estudo preliminar de determinação de amplitude como a dose para qual é previsível obter alguns sinais de toxicidade sem causar efeitos tóxicos graves ou mortalidade. Os sinais clínicos e as condições associadas com dor, sofrimento e morte iminente, são descritos detalhadamente num Documento de Orientações da OCDE separado (8). Outros grupos de animais poderão ser sujeitos a dosagens, com doses fixas superiores ou inferiores, consoante a presença ou ausência de sinais de toxicidade ou mortalidade. Repete-se este procedimento até identificação da dose que causa toxicidade evidente ou que provoque uma e apenas uma morte ou até à dose mais elevada no caso de não serem observados quaisquer efeitos. O procedimento é imediatamente interrompido no caso de se registarem mortes à dose mais baixa.
1.4 DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO
1.4.1 Selecção de espécies animais
A espécie preferida para ensaio é o rato, mas podem ser utilizadas outras espécies de roedores. Normalmente, utilizam-se fêmeas (7). Tal escolha deve-se ao facto de uma análise da literatura científica relativa aos ensaios convencionais de DL(índice 50) revelar que, habitualmente, a diferença de sensibilidade entre os sexos é pequena e, nos casos em que são observadas diferenças, as fêmeas são, de um modo geral, ligeiramente mais sensíveis (10). No entanto, devem utilizar-se machos caso as propriedades toxicológicas ou tóxicocinéticas descritas para substâncias químicas estruturalmente semelhantes, indicarem que estes podem revelar maior sensibilidade. Quando o ensaio é efectuado com machos, deve ser apresentada uma justificação adequada.
Devem ser utilizados animais adultos, jovens e saudáveis e pertencentes a estirpes laboratoriais de uso corrente. As fêmeas devem ser nulíparas e não grávidas. No início da administração das doses, todos os animais devem ter idades compreendidas entre as 8 e as 12 semanas e um peso compreendido no intervalo de (mais ou menos) 20% do peso médio dos animais aos quais foram anteriormente administradas doses.
1.4.2 Condições de alojamento e alimentação
A temperatura do compartimento experimental dos animais deve ser de 22ºC ((mais ou menos) 3ºC). A humidade relativa deverá ser 50-60%, embora sejam aceitáveis valores entre um mínimo de 30% e um máximo que, de preferência, não deverá exceder 70%, salvo durante os períodos de limpeza do compartimento. A iluminação deve ser artificial, com sequências de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão. A alimentação pode basear-se em dietas de laboratório convencionais, com fornecimento ilimitado de água para beber. Os animais aos quais é administrada a mesma dose, podem ser agrupados na mesma gaiola desde que, o número de animais em cada gaiola não impeça a observação clara de cada um deles.
1.4.3 Preparação dos animais
Os animais são escolhidos ao acaso, marcados de modo a permitir uma identificação individualizada e mantidos nas suas gaiolas durante, pelo menos, 5 dias antes do início da administração das doses de modo a permitir que se aclimatem às condições laboratoriais.
1.4.4 Preparação das doses
De um modo geral, as substâncias de ensaio devem ser administradas num volume constante ao longo de toda a gama de doses a ensaiar através da variação da concentração na preparação da dose. No entanto, para o caso do ensaio de um produto ou de uma mistura no estado líquido, pode ser mais relevante para a avaliação de risco subsequente, a utilização da substância de ensaio sem qualquer diluição, ou seja, a concentração constante, sendo este um requisito apresentado por algumas autoridades competentes. Em qualquer dos casos, não deve ser excedido o volume máximo da dose a ser administrada. O volume máximo de líquido que pode ser administrado de cada vez, depende do tamanho do animal de ensaio. No caso de roedores, em condições normais o volume não deve exceder 1 ml/100 g de peso corporal. Para soluções aquosas, contudo, pode ser considerada a dose de 2 ml/100 g de peso corporal. Recomenda-se que, sempre que possível, seja considerada em primeiro lugar a utilização de uma solução/suspensão/emulsão aquosa; caso tal não seja viável, pode considerar-se o uso de uma solução/suspensão/emulsão em óleo (por exemplo, óleo de milho); em última instância, poderá eventualmente recorrer-se ao uso de soluções noutros excipientes. Devem conhecer-se as características tóxicas dos excipientes que não sejam a água. As doses devem ser preparadas pouco tempo antes da sua administração, a menos que a estabilidade da preparação ao longo do período de utilização seja conhecida e tenha sido considerada aceitável.
1.5 PROCEDIMENTO
1.5.1 Administração de doses
A administração deve ser feita numa toma única, por sonda esofágica, usando tubo estomacal ou cânula de intubação apropriada. Nos casos raros em que não é possível a administração de uma toma única, a dose pode ser administrada em fracções menores ao longo de um período não superior a 24 horas.
Os animais devem ser sujeitos a jejum antes da administração das doses (por exemplo, no caso de ratos, não deve dar-se comida durante a noite, mas deve manter-seo fornecimento de água; no caso de ratinhos, a comida deve ser suspensa durante 3-4 horas e deve ser mantida o fornecimento de água). Após o período de jejum, os animais devem ser pesados e deve ser administrada a substância de ensaio. Após a administração da substância, pode evitar dar-se comida durante 3-4 horas para ratos e 1-2 horas para ratinhos. Nos casos de administração fraccionada da dose durante um certo lapso de tempo, pode ser necessário dar comida e água aos animais consoante a duração do período de administração.
1.5.2 Estudo de determinação de amplitude
O objectivo do estudo de determinação de amplitude consiste em seleccionar a dose inicial apropriada para o estudo principal. A substância de ensaio é administrada a um único animal de uma forma sequencial segundo os fluxogramas da parte 1. O estudo de determinação de amplitude termina quando se pode seleccionar a dose inicial para o estudo principal (ou se for registada uma morte à dose fixa mais baixa).
Para o estudo de determinação de amplitude, a dose inicial é seleccionada de entre as doses fixas de 5, 50, 300 e 2000 mg/kg, como sendo a dose que se prevê, poder causar toxicidade evidente com base, se possivel, nas evidências de dados in vivo e in vitro da mesma substância química ou de substâncias químicas estruturalmente semelhantes. Na ausência de tal informação, a dose inicial será de 300 mg/kg.
O intervalo de aplicação de doses a cada animal será de, pelo menos, 24 horas. Todos os animais devem ser observados durante um período de, pelo menos, 14 dias.
Excepcionalmente e apenas quando justificado por necessidades regulamentares específicas, pode ser considerada a utilização de uma dose fixa superior adicional de 5000 mg/kg (consultar a Parte 3). Por razões de protecção dos animais, é desencorajado o ensaio de animais na Categoria 5 do SHG (2000-5000 mg/kg). Esta dose só deve ser considerada quando existe uma elevada probabilidade dos resultados deste ensaio terem relevância directa na protecção dos animais, da saúde humana ou do ambiente.
Nos casos em que o animal de ensaio morre no estudo de determinação de amplitude quando se aplica a dose fixa mais baixa (5 mg/kg), o procedimento normal consiste em terminar o estudo e classificar a substância na Categoria 1 do GHS (tal como se indica na Parte 1). No entanto, se for necessária uma confirmação adicional, pode ser efectuado um procedimento experimental suplementar, tal como se descreve seguidamente. Aplica-se uma dose de 5 mg/kg a um segundo animal. Se o segundo animal morrer confirma-se a Categoria 1 do GHS e o estudo é imediatamente terminado. Se o segundo animal sobreviver, será então administrada a dose de 5 mg/kg a um máximo de mais três animais. Dado que neste caso o risco de mortalidade é elevado, a administração das doses a estes animais deve ser feita de um modo sequencial, de modo a proteger os animais. O intervalo, entre a aplicação da dose a cada um dos animais, deve ser suficiente para assegurar a provável sobrevivência do animal anterior. Se ocorrer uma segunda morte, a sequência de aplicação da dose será terminada imediatamente e não serão ensaiados mais animais. Dado que, a ocorrência de uma segunda morte (independentemente do número de animais ensaiados até ao final do estudo) é classificável no resultado A (2 ou mais mortes), segue-se a regra de classificação da Parte2 para a dose fixa de 5 mg/kg (Categoria 1, se ocorrerem 2 ou mais mortes, ou Categoria 2, se não ocorrer mais do que 1 morte). Além disso, apresentam-se na Parte 4 as orientações sobre a classificação segundo o sistema da UE, válido até à implementação do novo GHS.
1.5.3 Estudo principal
1.5.3.1 Número de animais e doses
Na Parte 2 apresentam-se os procedimentos a seguir após o ensaio com a dose inicial. É necessário proceder de uma das três formas seguintes: terminar os ensaios e classificar a substância na classe de perigosidade apropriada, prosseguir os ensaios como uma dose fixa superior, ou prosseguir os ensaios com uma dose fixa inferior. No entanto, por uma questão de protecção dos animais, a dose que causou morte, no estudo de determinação de amplitude, não deve ser repetida no estudo principal (consultar a Parte2). A experiência prévia é indicativa de que o resultado mais provável da dose inicial será a possibilidade de classificação da substância, o que torna desnecessários quaisquer ensaios adicionais.
Será normalmente utilizado um total de cinco animais do mesmo sexo para cada dose investigada. O grupo de cinco animais será constituído por um animal do estudo prévio, ao qual foi administrada a dose seleccionada e de quatro outros animais (excepto, em casos raros, se a dose utilizada no estudo principal não tiver sido incluída no estudo de determinação de amplitude).
O intervalo de tempo entre a aplicação de doses em cada nível é determinado pelo aparecimento, duração e gravidade dos sinais de toxicidade. O tratamento dos animais com a dose seguinte deve ser adiado até ser possível estabelecer com segurança a sobrevivência dos animais previamente tratados. Recomenda-se um período de 3 ou 4 dias entre a administração das doses para cada nível de dosagem, se necessário, de modo a permitir a detecção de efeitos tóxicos retardados. O intervalo de tempo pode ser ajustado se necessário, por exemplo, em caso de resposta inconclusiva.
No caso de se considerar a utilização da dose fixa máxima de 5000 mg/kg, deve proceder-se em conformidade com o procedimento descrito na Parte 3. (Consultar igualmente a secção 1.6.2.)
1.5.3.2 Teste-limite
O teste-limite é utilizado, essencialmente, em situações nas quais o analistatem informação indicativa de o material de ensaio não ser provavelmente tóxico, ou seja, só apresenta toxicidade acima das doses limite regulamentadas. A informação sobre a toxicidade do material de ensaio pode ser obtida a partir de ensaios em compostos semelhantes ou de ensaios de misturas ou produtos semelhantes, tendo em consideração a identificação e percentagem dos componentes cuja relevância toxicológica é conhecida. Nos casos em que a informação sobre a toxicidade, do material de ensaio, é limitada ou inexistente, ou nos casos em que é previsível que o material a ensaiar seja tóxico, deve ser efectuado o estudo principal.
Usando o procedimento normal para este ensaio, o teste-limite pode ser efectuado graças a um estudo de determinação de amplitude com uma dose inicial de 2000 mg/kg (ou, excepcionalmente, de 5000 mg/kg), seguido da administração da dose a mais quatro animais.
1.6 OBSERVAÇÕES
Após a aplicação da dose, os animais devem ser observados individualmente pelo menos uma vez durante os primeiros 30 minutos e periodicamente durante as primeiras 24 horas, com especial cuidado nas primeiras 4 horas. Seguidamente, é necessário observar os animais diariamente durante um período de 14 dias, excepto se for necessário retirá-los do estudo e sacrificá los, sem dor, por motivo do bem estar dos animais, ou se forem encontrados mortos. No entanto, a duração do período de observação não deve ser estabelecida de uma forma rígida, mas determinada com base nas reacções de toxicidade, velocidade do seu aparecimento e duração do período de recuperação, que pode ser prolongado, se for considerado necessário. O momento em que os sinais de toxicidade aparecem e desaparecem são importantes, sobretudo se os sinais de toxicidade tendem a aparecer de uma forma retardada (11). Todas as observações são registadas sistematicamente, mantendo-se uma ficha individual para cada animal.
Serão necessárias observações adicionais se os animais continuaram a apresentar sinais de toxicidade. As observações devem incluir alterações na pele e pêlos, olhos e membranas mucosas, aparelho respiratório, aparelho circulatório, sistema nervoso autónomo e central, assim como da actividade somatomotora e comportamental. Devem ser observados com especial atenção os tremores, convulsões, salivação, diarreia, letargia, sono e coma. Devem ser tomados em consideração os princípios e critérios resumidos no Documento de Orientação de Critérios Específicos sem Dor (8). Os animais que forem encontrados em estado moribundo e os animais que apresentarem dores violentas ou sinais de sofrimento grave e continuado devem ser sacrificados sem dor. Quando os animais forem sacrificados a fim de evitar dor ou se forem encontrados mortos, deve ser registado o momento da morte com o maior rigor possível.
1.6.1 Peso corporal
O peso individual dos animais deve ser determinado pouco antes da administração da substância de ensaio e, seguidamente, pelo menos uma vez por semana. Devem ser calculadas e registadas todas as variações de peso. No final do ensaio, os animais sobreviventes são pesados e, seguidamente, sacrificados sem dor.
1.6.2 Patologia
Todos os animais de ensaio (incluindo os que morreram durante o ensaio ou que foram retirados do ensaio por motivos de preservação do seu bem estar) devem ser sujeitos a uma autópsia pouco pormenorizada. Devem ser registadas as alterações patológicas principais observadas em cada animal. Deve também ser considerada a realização de um exame microscópico dos órgãos que mostrem sinais de patologia grave em animais que sobreviveram, no mínimo, durante 24 horas após a aplicação da dose inicial, já que este exame pode fornecer informação útil.
2 DADOS
Devem ser apresentados os dados individuais para cada animal. Adicionalmente, todos os dados devem ser resumidos em forma tabular, mostrando, para cada grupo de ensaio, o número de animais utilizado, o número de animais que apresentaram sinais de toxicidade, o número de animais que foram encontrados mortos durante o ensaio ou que foram sacrificados a fim de evitar dor, o momento da morte de cada um dos animais, a descrição e evolução temporal dos efeitos de toxicidade e sua reversibilidade, assim como os resultados da autópsia.
3 RELATÓRIO
3.1 RELATÓRIO DO ENSAIO
O relatório do ensaio deverá incluir as seguintes informações:
Substância de ensaio:
– natureza física, pureza e propriedades físico-químicas relevantes (incluindo isomerização);
– dados relativos à identificação química, incluindo número CAS.
Excipiente (se apropriado):
– caso o excipiente não seja água, uma justificação para a sua escolha.
Animais de ensaio:
– espécie/estirpe usada;
– estado microbiológico do animal, caso seja conhecido;
– número, idade e sexo dos animais (incluindo, quando necessário, uma justificação para o uso de machos em vez de fêmeas);
– proveniência, condições de alojamento, dieta, etc.;
Condições do ensaio:
– informação pormenorizada sobre a formulação da substância de ensaio, incluindo informação detalhada sobre a forma física do material administrado;
– informação pormenorizada sobre a administração da substância de ensaio, incluindo volume das doses e momento de aplicação;
– informação pormenorizada sobre a qualidade dos alimentos e da água (incluindo tipo e origem da dieta e origem da água)
– justificação para a escolha da dose inicial.
Resultados:
– tabela dos dados de resposta e da dose para cada animal (ou seja, animais que apresentaram sinais de toxicidade, incluindo mortalidade, natureza, gravidade e duração dos efeitos);
– tabela com indicação do peso corporal e suas variações;
– pesos individuais de animais no dia em que é aplicada a dose, uma vez por semana no restante período e na altura da sua morte ou sacrifício;
– data e momento da morte, no caso de ocorrência de morte antes do sacrifício previsto;
– evolução temporal do aparecimento de sintomas de toxicidade e sua reversibilidade, para cada animal;
– resultados da autópsia e resultados histopatológicos para cada animal, caso se encontrem disponíveis.
Análise dos resultados.
Conclusões.
4 REFERÊNCIAS
(1) British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). Special report: a new approach to the classification of substances and preparations on the basis of their acute toxicity. Biometrics, 20, 385.
(2) Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. e Shillaker, R.O. (1987). Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparations for their acute toxicity. Human Toxicol. 6, 279-291.
(3) Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J. e Walker, A.P. (1990). The international validation of a fixed-dose procedure as an alternative to the classical LD(índice 50) test. Fd. Chem. Toxicol. 28, 469-482.
(4) Whitehead, A. e Curnow, R.N. (1992). Statistical evaluation of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, 313-324.
(5) Stallard, N. e Whitehead, A. (1995). Reducing numbers in the fixed-dose procedure. Human Exptl. Toxicol. 14, 315-323.
(6) Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002). Statistical evaluation of the revised fixed dose procedure. Hum. Exp. Toxicol., 21, 183 -196.
(7) OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris
(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assesment N. 19.
(9) OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Classification for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-52 1-14-no-24-no-0,FF.html].
(10) Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, J.A. e Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up-and-Down, Conventional LD(índice 50), and Fixed-Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, 223-231.
(11) Chan P.K e A.W. Hayes (1994) Chapter 16 Acute Toxicity and Eye Irritation . Em: Principles and Methods of Toxicology. 3ª Edição. A.W. Hayes , Editor. Raven Press, Ltd. New York, USA.
PARTE 1: FLUXOGRAMA PARA O ESTUDO DE DETERMINAÇÃO DE AMPLITUDE
(ver fluxograma no documento original)
PARTE 2: FLUXOGRAMA PARA O ESTUDO PRINCIPAL
(ver fluxograma no documento original)
PARTE 3
CRITÉRIOS PARA A CLASSIFICAÇÃO DE SUBSTÂNCIAS DE ENSAIO COM VALORES PREVISÍVEIS DE LD(índice 50) SUPERIORES A 2000 MG/KG PARA AS QUAIS NÃO É NECESSÁRIO EFECTUAR ENSAIO.
Os critérios para a Categoria 5 de perigosidade destinam-se a permitir a identificação de substâncias de ensaio que representam um perigo de toxicidade aguda relativamente baixo, mas que, em certas circunstâncias, podem representar perigo para populações vulneráveis. É previsível que estas substâncias apresentem valores de DL(índice 50) orais ou dérmicos na gama de 2000-5000 mg/kg ou dose equivalente para outras vias. As substâncias de ensaio podem ser classificadas na categoria de perigosidade definida por: 2000 mg/kg (menor que) DL(índice 50) (menor que) 5000 mg/kg (Categoria 5 do GHS) nos seguintes casos:
a) se classificadas nesta categoria por qualquer dos esquemas de ensaio da Parte 2, baseados nas incidências de mortalidade;
b) se houver prova fiável indicativa de que os valores de DL(índice 50) se encontram na gama correspondente à Categoria 5 ou se outros estudos em animais ou sobre efeitos de toxicidade em seres humanos forem indicativos de preocupação acentuada em relação à salvaguarda da saúde humana;
c) através de extrapolação, estimativa ou medição de dados, desde que não seja garantida a atribuição a uma classe mais perigosa, e
– quando existe informação fiável indicativa de efeitos de toxicidade significativos em seres humanos, ou
– quando não é registada mortalidade nos ensaios por via oral até doses correspondentes aos valores para a Categoria 4, ou
– quando os especialistas são da opinião de que não se verificam sintomas clínicos de toxicidade significativos para ensaios até doses com valores correspondentes à Categoria 4, com excepção de diarreia, erecção pilosa ou má aparência, ou
– nos casos em que os especialistas confirmem a existência de informação fiável, proveniente de outros estudos com animais, indicativa da existência de potenciais efeitos agudos significativos.
ENSAIOS COM DOSES SUPERIORES A 2000 MG/KG
Apenas pode ser considerada a utilização de uma dose fixa superior adicional de 5000 mg/kg, em casos excepcionais e justificados por necessidades específicas legais. Devido ao reconhecimento da necessidade de proteger o bem-estar dos animais, os ensaios com doses de 5000 mg/kg são desencorajados e só devem ser considerados no caso de ser muito provável que os resultados desse ensaio tenham especial relevância para a protecção animal ou da saúde humana (9).
Estudo de determinação de amplitude
As regras de decisão para o procedimento sequencial apresentado, na Parte 1, serão aplicadas ao ensaio com dose de 5000 mg/kg. Assim, quando se utiliza uma dose de 5000 mg/kg no estudo de determinação de amplitude, o resultado A (morte) requer o ensaio com um segundo animal com uma dose de 2000 mg/kg. Os resultados B e C (toxicidade evidente ou sem toxicidade) permitem a selecção da dose de 5000 mg/kg, como dose inicial do estudo principal. De igual modo, para uma dose inicial diferente de 5000 mg/kg, o ensaio é realizado até à dose de 5000 mg/kg se o resultado da dose de 2000 mg/kg for B ou C. No caso de se obter um resultado A na subsequente dose de 5000 mg/kg, a dose inicial do estudo principal deverá ser 2000 mg/kg, enquanto para resultados B ou C deve utilizar-se uma dose inicial de 5000 mg/kg no estudo principal.
Estudo principal
As regras de decisão para o procedimento sequencial apresentado, na Parte 2, serão aplicadas ao ensaio com dose de 5000 mg/kg. Assim, quando se utiliza uma dose de 5000 mg/kg no estudo principal, o resultado A ((igual ou maior que) 2 mortes) requer o ensaio com um segundo grupo, com uma dose de 2000 mg/kg. Os resultados B (toxicidade evidente e/ou (igual ou menor que) 1 morte) ou C (sem toxicidade) não permitem a classificação da substância em conformidade com o GHS. De igual modo, para uma dose inicial diferente de 5000 mg/kg, o ensaio é realizado até à dose de 5000 mg/kg se o resultado da dose de 2000 mg/kg for C. No caso de se obter um resultado A na subsequente dose de 5000 mg/kg, a substância será classificada na Categoria 5 do GHS, enquanto um resultado B ou C não permite a classificação da substância.
PARTE 4
MÉTODO DE ENSAIO B.1 bis – Orientações em conformidade com o esquema transitório da UE, válido até à implementação total do Sistema de Classificação Harmonizado a Nível Mundial (GHS)
(obtido da referência (8))
(ver fluxogramas no documento original)
ANEXO VI
“B.1 tris. TOXICIDADE ORAL AGUDA – MÉTODO DE CLASSIFICAÇÃO DE TOXICIDADE AGUDA
1. MÉTODO
O presente método é equivalente ao “Test Guideline” TG 423 da OCDE (2001)
1.1 INTRODUÇÃO
O método de classificação de toxicidade aguda (1) estabelecido no presente ensaio é um procedimento gradual que utiliza 3 animais do mesmo sexo por etapa. Em média, consoante a mortalidade e/ou o estado moribundo dos animais, são necessárias 2-4 etapas para avaliar a toxicidade aguda da substância de ensaio. O presente procedimento é reprodutível, utiliza uma quantidade muito limitada de animais e permite classificar as substâncias de um modo semelhante a outros métodos de ensaio de toxicidade aguda. O método de classificação de toxicidade aguda baseia-se na avaliação biométrica (2)(3)(4)(5) com doses fixas, separadas apropriadamente de modo a permitir a avaliação da substância para fins de classificação e avaliação de perigosidade. O método, adoptado inicialmente em 1996, foi amplamente validado in vivo relativamente aos dados de DL(índice 50) publicados na literatura nacional (6) e internacional (7).
No Documento de Orientação sobre Ensaios de Toxicidade Oral Aguda (8) podem consultar se as orientações sobre a selecção do método de ensaio mais apropriado a determinado fim. Este Documento de Orientação contém igualmente informação adicional sobre o procedimento e interpretação do Método de Ensaio B.1tris.
No presente método de ensaio, não é necessário administrar doses de substâncias de ensaio, que comprovadamente causam dor e sofrimento óbvios, devido à sua acção corrosiva ou gravemente irritante. Os animais moribundos ou que apresentam sinais óbvios de dor ou sofrimento grave e continuado devem ser sacrificados sem dor e, na interpretação dos resultados do ensaio, considerados do mesmo modo que os animais que morrem durante o ensaio. Os critérios sobre a decisão de sacrificar animais moribundos ou em sofrimento, bem como as orientações sobre o reconhecimento de morte previsível ou iminente, estão incluídos separadamente num Documento de Orientação (9).
O presente método utiliza doses estabelecidas previamente e os resultados permitem classificar a substância em conformidade com o Sistema Harmonizado ao Nível Mundial (GHS) para a classificação de substâncias químicas que causam toxicidade aguda (10).
Em princípio, o método não se destina a calcular rigorosamente os valores de LD(índice 50), mas permite a determinação de gamas de exposição definidas, nas quais é expectável a ocorrência de mortes, dado que um dos principais critérios específicos, do presente ensaio, é a morte de uma dada proporção de animais. O método permite determinar valores de DL(índice 50) somente quando, pelo menos, duas das doses utilizadas resultam numa mortalidade superior a 0% e inferior a 100%. A utilização de uma selecção de doses, previamente estabelecidas, independentemente da substância de ensaio, com a classificação especificamente dependente do número de animais observados em vários estados melhora as condições de comunicação de resultados entre laboratórios, bem como a consistência e a repetibilidade dos resultados.
Antes de efectuar o estudo, o laboratório de ensaio deve ter em conta toda a informação disponível sobre a substância de ensaio. Esta informação incluirá a identificação e a estrutura química da substância, as suas propriedades físico-químicas, os resultados de quaisquer outros ensaios de toxicidade da substância in vitro ou in vivo, dados toxicológicos sobre substâncias estruturalmente semelhantes e a(s) utilização(ões) prevista(s) para a substância. Esta informação é necessária para satisfazer todos os envolvidos em relação à relevância do ensaio ao nível da protecção da saúde humana e será útil na determinação da dose inicial mais adequada.
1.2 DEFINIÇÕES
Toxicidade oral aguda: refere-se ao conjunto de efeitos adversos que se manifestam após a administração oral de uma dose única da substância ou de várias doses num período de 24 horas.
Morte retardada: significa que o animal não morre nem aparenta estar moribundo num período de 48 horas, mas morre mais tarde, no decorrer do período de observação de 14 dias.
Dose: quantidade aplicada da substância de ensaio. O valor da dose é expresso em peso de substância de ensaio por unidade de peso de animal de ensaio (por exemplo, mg/kg).
GHS: Sistema Harmonizado ao Nível Mundial (Globally Harmonised System) para a Classificação de Substâncias Químicas e Misturas. Trata-se de um trabalho conjunto da OCDE (saúde humana e ambiente), do Comité de Peritos em Transporte de Mercadorias Perigosas das Nações Unidas (propriedades físico-químicas) e da OIT (notificação de perigos) e coordenado pelo Programa Interorganizações para a Boa Gestão das Substâncias Químicas (Interorganisation Programme for the Sound Management of Chemicals [IOMC]).
Morte iminente: situação em que se prevê a ocorrência de estado moribundo ou morte antes da próxima observação planeada. Alguns dos sinais indicativos deste estado em roedores incluem convulsões, posição lateral, posição deitada e tremores. (Para informação detalhada, consultar o Documento de Orientação sobre Critérios Específicos sem Dor[9]).
DL(índice 50) (Dose Letal Média): dose única, calculada estatisticamente, de uma substância susceptível de causar a morte de 50% dos animais quando administrada por via oral. O valor da DL(índice 50) é expresso em peso de substância de ensaio por unidade de peso de animal de ensaio (mg/kg).
Dose-limite refere-se a uma dose com o valor limite superior admitido pelo ensaio (2000 ou 5000 mg/kg).
Estado moribundo: encontrar-se num estado de morte ou de incapacidade de sobrevivência, mesmo com tratamento. (Para informação detalhada, consultar o Documento de Orientação sobre Critérios Específicos sem Dor[9]).
Morte previsível: presença de sinais clínicos indicativos de ocorrência de morte em determinada altura, antes do final planeado da experiência; por exemplo: incapacidade de alcançar água ou comida. (Consultar o Documento de Orientação de Critérios Específicos sem Dor[9] para mais detalhes).
1.3 PRINCÍPIO DO ENSAIO
O princípio do presente ensaio é que, com base num procedimento gradual com a utilização de um número mínimo de animais por etapa, é possível obter informação suficiente sobre a toxicidade aguda de uma substância de ensaio, de modo a permitir a sua classificação. A substância é administrada, por via oral, a um grupo de animais de ensaio a uma das doses anteriormente definidas. A substância é ensaiada utilizando um procedimento gradual, em que cada etapa utiliza três animais do mesmo sexo (normalmente fêmeas). A existência ou inexistência de mortalidade, relacionada com composto, dos animais tratados numa dada etapa, determinará a etapa seguinte, ou seja:
– não são necessários mais ensaios,
– é administrada a mesma dose a mais três animais,
– é administrada a dose seguinte, maior ou menor, a mais três animais.
Na Parte 1 apresenta-se informação detalhada sobre o procedimento de ensaio. O método permitirá uma avaliação conducente à classificação da substância de ensaio numa das classes de toxicidade definidas pelos valores-limite de DL(índice 50).
1.4 DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO
1.4.1 Selecção de espécies animais
A espécie de roedores preferida para ensaio é o rato, mas podem ser utilizadas outras espécies de roedores. Normalmente, utilizam-se fêmeas (9). Tal escolha deve-se ao facto de uma análise da literatura científica relativa aos ensaios convencionais de DL(índice 50) revelar que, habitualmente, a diferença de sensibilidade entre os sexos é pequena e, nos casos em que são observadas diferenças, as fêmeas são, de um modo geral, ligeiramente mais sensíveis (11). No entanto, devem utilizar-se machos, caso as propriedades toxicológicas ou tóxicocinéticas descritas para substâncias químicas estruturalmente semelhantes indicarem que estes podem revelar maior sensibilidade. Quando o ensaio é efectuado com machos, deve ser apresentada uma justificação adequada.
Devem ser utilizados animais adultos, jovens e saudáveis e pertencentes a estirpes laboratoriais de uso corrente. As fêmeas devem ser nulíparas e não-grávidas. No início da administração das doses, todos os animais devem ter idades compreendidas entre as 8 e as 12 semanas e um peso compreendido no intervalo de (mais ou menos) 20% do peso médio dos animais aos quais foram anteriormente administradas doses.
1.4.2 Condições de alojamento e alimentação
A temperatura do compartimento experimental dos animais deve ser 22ºC ((mais ou menos) 3ºC). A humidade relativa deverá ser 50%-60%, embora sejam aceitáveis valores entre um mínimo de 30% e um máximo que, de preferência, não deverá exceder 70%, salvo durante os períodos de limpeza do compartimento. A iluminação deve ser artificial, com sequências de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão. A alimentação pode basear-se em dietas de laboratório convencionais, com fornecimento ilimitado de água para beber. Os animais aos quais é administrada a mesma dose podem ser agrupados na mesma gaiola, desde que o número de animais em cada gaiola não impeça a observação clara de cada um deles.
1.4.3 Preparação dos animais
Os animais são escolhidos ao acaso, marcados de modo a permitir uma identificação individualizada e mantidos nas suas gaiolas durante, pelo menos, 5 dias antes do início da administração das doses para que se aclimatem às condições laboratoriais.
1.4.4 Preparação das doses
De um modo geral, as substâncias de ensaio devem ser administradas num volume constante ao longo de toda a gama de doses a ensaiar através da variação da concentração na preparação da dose. No entanto, para o caso do ensaio de um produto ou de uma mistura no estado líquido, pode ser mais relevante para a avaliação de risco subsequente a utilização da substância de ensaio sem qualquer diluição, ou seja, a concentração constante, sendo este um requisito apresentado por algumas autoridades competentes. Em qualquer dos casos, não deve ser excedido o volume máximo da dose a ser administrada. O volume máximo de líquido que pode ser administrado de cada vez depende do tamanho do animal de ensaio. No caso de roedores, o volume não deve exceder, em condições normais, 1 ml/100 g de peso corporal. Para soluções aquosas, contudo, pode ser considerada a dose de 2 ml/100 g de peso corporal. Recomenda-se que, sempre que possível, seja considerada em primeiro lugar a utilização de uma solução/suspensão/emulsão aquosa; caso tal não seja viável, pode considerar-se o uso de uma solução/suspensão/emulsão em óleo (por exemplo, óleo de milho); em última instância, poderá eventualmente recorrer-se ao uso de soluções noutros excipientes. Devem conhecer-se as características toxicológicas dos excipientes que não sejam a água. As doses devem ser preparadas pouco tempo antes da sua administração, a menos que a estabilidade da preparação ao longo do período de utilização seja conhecida e tenha sido considerada aceitável.
1.5 PROCEDIMENTO
1.5.1 Administração de doses
A administração por sonda esofágica deve ser feita, de preferência, numa toma única, usando um tubo estomacal ou uma cânula de intubação apropriada. Nos casos raros em que não é possível a administração de uma toma única, a dose pode ser administrada em fracções menores ao longo de um período não superior a 24 horas.
Os animais devem ser sujeitos a jejum antes da administração das doses (por exemplo, no caso de ratos, não deve dar-se comida durante a noite, mas deve manter-se o fornecimento de água; no caso de ratinhos, a comida deve ser suspensa durante 3-4 horas e deve ser mantida o fornecimento de água). Após o período de jejum, os animais devem ser pesados e deve ser administrada a substância de ensaio. Após a administração da substância, pode evitar dar-se comida durante 3-4 horas para ratos e 1-2 horas para ratinhos. Nos casos de administração fraccionada da dose durante um certo lapso de tempo, pode ser necessário dar comida e água aos animais, consoante a duração do período de administração.
1.5.2 Número de animais e doses
São utilizados três animais em cada etapa. A dose a utilizar inicialmente deve ser seleccionada entre uma das quatro doses fixas de 5, 50, 300 e 2000 mg/kg de peso corporal. A dose inicial deve ser aquela que apresenta maior probabilidade de induzir mortalidade em alguns dos animais tratados. Os fluxogramas da Parte 1 descrevem o procedimento a seguir para cada uma das doses iniciais. Apresentam-se ainda, na Parte 2 as orientações sobre a classificação segundo o sistema da UE, em vigor até à implementação do novo GHS.
Quando a informação disponível for indicativa de que não é muito provável que ocorra mortalidade com a maior dose inicial (2000 mg/kg de peso corporal), deve efectuar-se um teste-limite. Quando não existir qualquer informação disponível sobre a substância de ensaio, recomenda-se a utilização de uma dose inicial de 300 mg/kg de peso corporal por razões de protecção dos animais.
O intervalo de tempo entre os grupos de tratamento é determinado pelo aparecimento, duração e gravidade dos sinais de toxicidade. O tratamento dos animais com a dose seguinte deve ser adiado até ser possível estabelecer com segurança a sobrevivência dos animais previamente tratados.
Excepcionalmente e apenas quando justificado por necessidades legais específicas, pode ser considerada a utilização de uma dose fixa superior adicional de 5000 mg/kg (consultar a Parte 2). Por razões de protecção dos animais, é desencorajado o ensaio de animais na Categoria 5 do SHG (2000-5000 mg/kg) e esta dose só deve ser considerada quando existe uma elevada probabilidade dos resultados deste ensaio terem relevância directa para a protecção da saúde humana ou dos animais ou do ambiente.
1.5.3 Teste-limite
O teste-limite é utilizado, essencialmente, em situações nas quais o analista tem informação indicativa do material de ensaio não ser provavelmente tóxico, ou seja, só apresenta toxicidade acima das doses limite regulamentadas. A informação sobre a toxicidade do material de ensaio pode ser obtida a partir de ensaios em compostos semelhantes ou de ensaios de misturas ou produtos semelhantes, tendo em consideração a identificação e percentagem dos componentes cuja relevância toxicológica é conhecida. Nos casos em que a informação sobre a sua toxicidade é limitada ou inexistente ou nos casos em que é previsível que o material a ensaiar seja tóxico, deve ser efectuado o estudo principal.
Pode ser efectuado um teste-limite a uma dose de 2000 mg/kg de peso corporal com seis animais (três animais por etapa). Excepcionalmente, pode ser efectuado um teste-limite a uma dose de 5000 mg/kg de peso corporal com três animais (consultar a Parte 2). Caso ocorra mortalidade na sequência da administração da substância de ensaio, pode ser necessário efectuar ensaios posteriores com a dose inferior seguinte.
1.6 OBSERVAÇÕES
Após a aplicação da dose, os animais devem ser observados individualmente, pelo menos uma vez durante os primeiros trinta minutos e periodicamente durante as primeiras 24 horas, com especial cuidado nas primeiras 4 horas. Em seguida, é necessário observar os animais diariamente, durante um período de 14 dias, excepto se for necessário retirá-los do estudo e sacrificá-los sem dor por motivo do bem estar dos animais ou se forem encontrados mortos. No entanto, a duração do período de observação não deve ser estabelecido de uma forma rígida, mas determinado com base nas reacções de toxicidade, velocidade do seu aparecimento e duração do período de recuperação, que pode ser prolongado, se considerado necessário. O momento em que os sinais de toxicidade aparecem e desaparecem são importantes, sobretudo se os sinais de toxicidade tendem a aparecer de uma forma retardada (12). Todas as observações são registadas sistematicamente, mantendo-se uma ficha individual para cada animal.
Serão necessárias observações adicionais se os animais continuaram a apresentar sinais de toxicidade. As observações devem incluir alterações na pele e pêlos, olhos, membranas mucosas, aparelho respiratório, aparelho circulatório, sistema nervoso autónomo e central, assim como na actividade somatomotora e comportamental. Devem ser observados com especial atenção os tremores, convulsões, salivação, diarreia, letargia, sono e coma. Devem ser tomados em consideração os princípios e critérios resumidos no Documento de Orientação de Critérios Específicos sem Dor (9). Os animais que forem encontrados em estado moribundo e os animais que apresentarem dores violentas ou sinais de sofrimento intenso e continuado, devem ser sacrificados sem dor. Quando os animais forem sacrificados a fim de evitar dor ou se forem encontrados mortos, deve ser registado o momento da morte com o maior rigor possível.
1.6.1 Peso corporal
O peso individual dos animais deve ser determinado imediatamente após a administração da substância de ensaio e, seguidamente, pelo menos uma vez por semana. Devem ser calculadas e registadas todas as variações de peso. No final do ensaio, os animais sobreviventes são pesados e, seguidamente, sacrificados sem dor.
1.6.2 Patologia
Todos os animais de ensaio (incluindo aqueles que morreram durante o ensaio ou que foram retirados do ensaio por motivos de preservação do bem-estar do animal) devem ser sujeitos a uma autópsia pouco pormenorizada. Devem ser registadas as alterações patológicas principais observadas em cada animal. Deve também ser considerada a realização de um exame microscópico dos órgãos que mostrem sinais de patologia grave em animais que sobreviveram, no mínimo, 24 horas após a aplicação da dose inicial, já que este exame pode fornecer informação útil.
2. DADOS
Devem ser apresentados os dados individuais para cada animal. Adicionalmente, todos os dados devem ser resumidos em forma tabular, mostrando, para cada grupo de ensaio, o número de animais utilizado, o número de animais que apresentaram sinais de toxicidade, o número de animais que foram encontrados mortos durante o ensaio ou que foram sacrificados a fim de evitar dor, o momento da morte de cada um dos animais, a descrição e evolução temporal dos efeitos de toxicidade e sua reversibilidade, assim como os resultados da autópsia.
3. RELATÓRIO
3.1 RELATÓRIO DO ENSAIO
O relatório do ensaio deverá incluir as seguintes informações:
Substância de ensaio:
– natureza física, pureza e propriedades físico-químicas relevantes (incluindo isomerização);
– dados relativos à identificação química, incluindo o número CAS.
Excipiente (se apropriado):
– caso o excipiente não seja água, uma justificação para a sua escolha.
Animais de ensaio:
– espécie/estirpe usada;
– estado microbiológico do animal, caso seja conhecido;
– número, idade e sexo dos animais (incluindo, quando necessário, uma justificação para o uso de machos em vez de fêmeas);
– proveniência, condições de alojamento, dieta, etc.
Condições do ensaio:
– informação pormenorizada sobre a formulação da substância, incluindo informação pormenorizada sobre a forma física do material administrado;
– informação pormenorizada sobre a administração da substância de ensaio, incluindo volume das doses e o momento da aplicação;
– informação pormenorizada sobre a qualidade dos alimentos e da água (incluindo tipo e origem da dieta, origem da água).
– justificação para a escolha da dose inicial.
Resultados:
– tabela dos dados de resposta e da dose para cada animal (ou seja, animais que apresentaram sinais de toxicidade, incluindo mortalidade, natureza, gravidade e duração dos efeitos);
– tabela com indicação do peso corporal e suas variações;
– pesos individuais de animais no dia em que é aplicada a dose, uma vez por semana no restante período e na altura da sua morte ou sacrifício;
– data e momento da morte, no caso de ocorrência de morte antes do sacrifício previsto;
– evolução temporal do aparecimento de sintomas de toxicidade e sua reversibilidade para cada animal;
– resultados da autópsia e resultados histopatológicos para cada animal, caso se encontrem disponíveis.
Análise dos resultados.
Conclusões.
4 REFERÊNCIAS
(1) Roll R., Höfer-Bosse Th. And Kayser D. (1986). New Perspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., Suppl. 31, 86
(2) Roll R., Riebschläger M., Mischke U. and Kayser D. (1989). Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizität von Chemikalien. Bundesgesundheitsblatt 32, 336-341.
(3) Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1994). The Biometric Evaluation of the Acute Toxic Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, 559-610
(4) Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1995). The Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 729-734.
(5) Diener W., and Schlede E. (1999) Acute Toxicity Class Methods: Alterations to LD/LC(índice 50) Tests. ALTEX 16, 129-134
(6) Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992). A National Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method – An Alternative to the LD(índice 50) Test. Arch. Toxicol. 66, 455-470.
(7) Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994). The International Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 659-670.
(8) OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris.
(9) OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N 19.
(10)OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System For Human Health And Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-52 1-14-no-24-no-0,FF.html].
(11)Lipnick R L, Cotruvo, J A, Hill R N, Bruce R D, Stitzel K A, Walker A P, Chu I; Goddard M, Segal L, Springer J A and Myers R C (1995) Comparison of the Up and Down, Conventional LD(índice 50), and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol 33, 223-231.
(12) Chan P.K. and A.W. Hayes. (1994 ). Chap. 16. Acute Toxicity and Eye Irritancy. Principles and Methods of Toxicology. Third Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA.
PARTE 1
PROCEDIMENTO A SEGUIR PARA CADA UMA DAS DOSES INICIAIS
CONSIDERAÇÕES GERAIS
Os esquemas de ensaio, descritos na presente Parte, descrevem esquematicamente o procedimento a seguir para cada dose inicial.
– PARTE 1A: A dose inicial é de 5 mg/kg p.c.
– PARTE 1B: A dose inicial é de 50 mg/kg p.c.
– PARTE 1C: A dose inicial é de 300 mg/kg p.c.
– PARTE 1D: A dose inicial é de 2000 mg/kg p.c.
Consoante o número de animais sacrificados sem dor ou mortos, o procedimento de ensaio segue as setas respectivas.
PARTE 1A
PROCEDIMENTO DE ENSAIO COM UMA DOSE INICIAL DE 5 MG/KG DE PESO CORPORAL
(ver fluxograma no documento original)
PARTE 1B
PROCEDIMENTO DE ENSAIO COM UMA DOSE INICIAL DE 50 MG/KG DE PESO CORPORAL
(ver fluxograma no documento original)
PARTE 1C
PROCEDIMENTO DE ENSAIO COM UMA DOSE INICIAL DE 300 MG/KG DE PESO CORPORAL
(ver fluxograma no documento original)
PARTE 1D
PROCEDIMENTO DE ENSAIO COM UMA DOSE INICIAL DE 2000 MG/KG DE PESO CORPORAL
(ver fluxograma no documento original)
PARTE 2
CRITÉRIOS PARA A CLASSIFICAÇÃO DE SUBSTÂNCIAS DE ENSAIO COM VALORES PREVISÍVEIS DE LD(índice 50) SUPERIORES A 2000 MG/KG SEM NECESSIDADE DE EFECTUAR ENSAIO
Os critérios para a Categoria de Perigosidade 5 destinam-se a permitir a identificação de substâncias de ensaio que representam um perigo de toxicidade aguda relativamente baixo, mas que, em certas circunstâncias, podem representar perigo para populações vulneráveis. É previsível que tais substâncias apresentem valores de DL(índice 50) por via oral ou dérmica na gama de 2000-5000 mg/kg ou dose equivalente para outras vias. As substâncias de ensaio podem ser classificadas na categoria de perigosidade definida por: 2000 mg/kg (menor que) DL(índice 50) (maior que) 5000 mg/kg (Categoria 5 do GHS) nos seguintes casos:
a) se classificadas nesta categoria por qualquer dos esquemas de ensaio constantes dos Fluxogramas da Parte 1 (1a-1d), baseados nas incidências de mortalidade;
b) se existir prova fiável indicativa de que os valores de DL(índice 50) se encontram na gama correspondente à Categoria 5 ou se outros estudos em animais ou sobre efeitos de toxicidade em seres humanos forem indicativos de preocupação acentuada em relação à salvaguarda da saúde humana;
c) através de extrapolação, estimativa ou medição de dados, desde que não seja garantida a atribuição a uma classe mais perigosa, e
– quando existe informação fiável indicativa de efeitos de toxicidade significativos em seres humanos, ou
– quando não é registada mortalidade nos ensaios por via oral até doses correspondentes aos valores para a Categoria 4, ou
– quando o perito é de opinião de que não se verificam sintomas clínicos de toxicidade significativos para ensaios até doses com valores correspondentes à Categoria 4, com excepção de diarreia, erecção pilosa ou má aparência, ou
– nos casos em que o perito confirme a existência de informação fiável, proveniente de outros estudos em animais que seja indicativa da existência de potenciais efeitos agudos significativos.
ENSAIOS COM DOSES SUPERIORES A 2000 MG/KG
Devido ao reconhecimento da necessidade de proteger o bem-estar dos animais, os ensaios de animais na Categoria 5 (5000 mg/kg) são desencorajados e só devem ser considerados no caso de ser muito provável que os resultados desse ensaio tenham especial relevância para a protecção da saúde humana ou animal (10). Não devem ser efectuados ensaios a doses superiores.
Quando é necessário efectuar o ensaio com uma dose de 5000 mg/kg, só é necessária uma etapa (ou seja, três animais). Se o primeiro animal tratado morre, o ensaio prossegue a uma dose de 2000 mg/kg, em conformidade com os fluxogramas da Parte 1. Se o primeiro animal sobrevive, são tratados dois outros animais. Se somente um dos três animais morrer, é de prever que o valor de DL(índice 50) seja superior a 5000 mg/kg. Se ambos os animais morrerem, o ensaio prossegue com uma dose de 2000 mg/kg.”
PARTE 3
MÉTODO DE ENSAIO B.1 tris: Orientações sobre a classificação em conformidade com o esquema transitório da UE em vigor até à implementação total do Sistema de Classificação Harmonizado ao Nível Mundial (GHS)
(obtido da referência (8))
(ver fluxogramas no documento original)
ANEXO VII
“B. 4. TOXICIDADE AGUDA: IRRITAÇÃO/CORROSÃO DÉRMICA
1. MÉTODO
O presente método baseia-se na publicação OECD TG 404 (2002) (normas de ensaio da OCDE).
1.1 INTRODUÇÃO
Na preparação do presente método optimizado foi dada especial atenção aos possíveis melhoramentos através da avaliação de toda a informação já existente sobre a substância de ensaio, de modo a evitar testes desnecessários em animais de laboratório e assim ter em consideração a problemática da protecção dos animais. O presente método inclui a recomendação de se levar a cabo uma análise da importância das provas de todos os dados relevantes existentes antes de se efectuar o ensaio in vivo descrito para irritação/corrosão pela substância. No caso de não se encontrarem disponíveis dados suficientes, estes podem ser obtidos através da aplicação de ensaios sequenciais (1). A estratégia de ensaio recomendada inclui a execução de ensaios in vitro validados e aceites e é fornecida na Parte 1 do presente método. Além disso, quando for apropriado, recomenda-se a aplicação sucessiva (não simultânea) de três pensos de ensaio ao animal no ensaio in vivo inicial.
Tendo em consideração o interesse científico e a protecção dos animais, não devem ser efectuados ensaios in vivo até