Segurança Alimentar Desde 2004 a tratar da Segurança Alimentar em Portugal
Decreto-Lei n.º 249/2007
PÁGINAS DO DR : 4095 a 4133
A doença provocada pelo agente patogénico Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., vulgarmente designada por doença do pus ou mal murcho da batateira e do mal murcho tomateiro, é um factor de redução da produção da cultura da batateira e do tomateiro, representando um risco para estas culturas não só no País como também em todo o território comunitário se não forem tomadas medidas de protecção eficazes.
Tornou-se, pois, necessário estabelecer medidas de controlo fitossanitário destinadas a evitar a introdução e a dispersão daquele agente patogénico no território nacional, competindo, para o efeito, à Direcção-Geral da Agricultura e Desenvolvimento Rural a definição, a elaboração, a coordenação e a aplicação do programa nacional de prospecção do organismo prejudicial.
Neste contexto, foi publicado o Decreto-Lei n.º 494/99, de 18 de Novembro, transpondo a Directiva n.º 98/57/CE, do Conselho, de 20 de Julho, relativa ao controlo de Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., que definiu os procedimentos a adoptar para a implementação do referido programa, através nomeadamente de disposições técnicas quanto à forma de conservação das amostras testadas e rastreabilidade do organismo prejudicial.
Foi, entretanto, publicada a Directiva n.º 2006/63/CE, da Comissão, de 14 de Julho, que veio alterar os anexos II a VII da Directiva n.º 98/57/CE, do Conselho, de 20 de Julho. Estes anexos constituem praticamente todo o corpo da directiva e foram alterados, quer para fazer face aos avanços significativos em termos da compreensão da biologia, dos procedimentos de detecção e de identificação do agente patogénico quer para enquadrar a experiência obtida na luta contra aquele organismo prejudicial através da revisão de várias disposições técnicas relacionadas com as medidas de controlo.
No tocante aos procedimentos de detecção e de identificação, foram introduzidos procedimentos recentemente desenvolvidos como a hibridação fluorescente in situ (FISH), a reacção em cadeia da polimerase (PCR), bem como melhorias nos diversos métodos laboratoriais a utilizar.
Quanto aos elementos técnicos das medidas de controlo, introduzem-se disposições que permitem melhorar a forma de conservação das amostras testadas, no sentido de assegurar a rastreabilidade do organismo prejudicial, a reunião dos elementos necessários para determinar a dimensão provável da contaminação, os pormenores da notificação de qualquer presença confirmada do organismo prejudicial e da zona contaminada relevante e a aplicação das medidas em locais de produção designados como contaminados e no interior das zonas demarcadas.
Deste modo, face à obrigatoriedade de proceder à transposição da Directiva n.º 2006/63/CE, da Comissão, de 14 de Julho, aliada ao facto de ser necessário actualizar, por um lado, não só todo o regime específico de medidas fitossanitárias aplicáveis mas também as referências aos serviços oficiais com competências na matéria, e por outro, enquadrar tais disposições com o actual regime fitossanitário aprovado pelo Decreto-Lei n.º 154/2005, de 6 de Setembro, importa que se opte por publicar um decreto-lei que comporte a consolidação legislativa de toda a matéria em apreço, revogando, em consequência, o citado Decreto-Lei n.º 494/99, de 18 de Novembro.
Foram ouvidos os órgãos de governo próprio das Regiões Autónomas.
Foi promovida a audição do Conselho Nacional do Consumo.
Assim:
Nos termos da alínea a) do n.º 1 do artigo 198.º da Constituição, o Governo decreta o seguinte:
CAPÍTULO I
Disposições gerais
Artigo 1.º
Transposição de directivas
O presente decreto-lei transpõe para a ordem jurídica interna a Directiva n.º 2006/63/CE, da Comissão, de 14 de Julho, que altera os anexos II a VII da Directiva n.º 98/57/CE, do Conselho, de 20 de Julho, relativa ao controlo de Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., procedendo, simultaneamente, à consolidação legislativa da transposição de ambas as directivas.
Artigo 2.º
Objecto
1 – O presente decreto-lei estabelece as medidas de controlo fitossanitário a adoptar em relação à bactéria Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., causadora da doença do pus ou mal murcho da batateira e do mal murcho tomateiro, a seguir designada por organismo prejudicial, no sentido de evitar o seu aparecimento, e, uma vez detectada, localizá-la e determinar a sua distribuição, evitar a sua dispersão e combatê-la com vista à sua eventual erradicação.
2 – O disposto no presente decreto-lei é aplicável, sem prejuízo do disposto no Decreto-Lei n.º 154/2005, de 6 de Setembro, que actualiza o regime fitossanitário que cria e define as medidas de protecção fitossanitária destinadas a evitar a introdução e dispersão no território nacional e comunitário, incluindo nas zonas protegidas, de organismos prejudiciais aos vegetais e produtos vegetais qualquer que seja a sua origem ou proveniência.
CAPÍTULO II
Controlo do organismo prejudicial
Artigo 3.º
Prospecção oficial
1 – Para efeitos do disposto no número anterior, a Direcção-Geral da Agricultura e Desenvolvimento Rural (DGADR) define, elabora e coordena a aplicação do programa nacional de prospecção do organismo prejudicial, cuja execução se realiza anualmente.
2 – A execução do programa de prospecção referido no número anterior cabe aos serviços de inspecção fitossanitária das direcções regionais de agricultura e pescas (DRAP) e dos correspondentes organismos das Regiões Autónomas dos Açores e da Madeira, nas respectivas áreas de actuação.
3 – As prospecções previstas no programa nacional são realizadas em conformidade com o disposto no n.º 1 da secção II do anexo I do presente decreto-lei, que dele faz parte integrante, e incidem obrigatoriamente sobre as plantas constantes da lista a que se refere a secção I do anexo I, a seguir designadas por materiais vegetais.
4 – De acordo com a avaliação do risco de dispersão do organismo prejudicial efectuada no decurso da execução do programa referido no n.º 1, as prospecções podem ser realizadas, utilizando métodos adequados, em zonas de produção de batata, tomate e outras solanáceas e em viveiros de tomateiro, assim como em locais de transformação industrial e centros de embalagem.
5 – Igualmente de acordo com a avaliação do risco de dispersão do organismo prejudicial efectuada no decurso da execução do programa referido no n.º 1, as prospecções podem ainda incidir sobre outras plantas solanáceas, para além dos materiais vegetais, e infestantes da mesma família, águas superficiais utilizadas para rega dos materiais vegetais, resíduos líquidos de descarga e resíduos sólidos provenientes de instalações de transformação industrial de batata e tomate ou de embalagem de batata, meios de cultura e solo, a seguir designados por outros materiais, recorrendo a métodos adequados, e, quando necessário, com colheita de amostras que são submetidas a testes laboratoriais oficiais ou oficialmente controlados.
6 – O método de diagnóstico, detecção e identificação do organismo prejudicial nos materiais vegetais é o referido no anexo II do presente decreto-lei, que dele faz parte integrante, devendo ser utilizado, nos outros materiais, qualquer outro método adequado oficialmente aprovado.
7 – A DGADR deve comunicar anualmente à Comissão Europeia e aos demais Estados membros os resultados da execução do programa nacional de prospecção do organismo prejudicial, em conformidade com o disposto no n.º 2 da secção II do anexo I.
Artigo 4.º
Dever de informação em relação ao organismo prejudicial
Qualquer pessoa que saiba ou suspeite da presença do organismo prejudicial em qualquer dos materiais vegetais ou nos outros materiais deve informar de imediato os serviços de inspecção fitossanitária das DRAP ou a DGADR.
Artigo 5.º
Procedimentos no caso de suspeita da presença
do organismo prejudicial
1 – Considera-se estar perante uma ocorrência suspeita quando a confirmação da presença do organismo prejudicial se tenha verificado por meio de:
a) Observação de sintomas de diagnóstico da doença causada pelo organismo prejudicial e se obteve um resultado positivo no ou nos testes rápidos de rastreio, definidos no n.º 1 da secção I e na secção II do anexo II; ou
b) Obtenção de um resultado positivo no ou nos testes de rastreio definidos no n.º 2 da secção I e na secção III do anexo II.
2 – Em caso de ocorrência suspeita, os serviços de inspecção fitossanitária da DRAP competente devem:
a) Assegurar a realização de testes laboratoriais oficiais ou oficialmente controlados, conforme previsto no n.º 6 do artigo 3.º, de acordo com as condições definidas no n.º 1 do anexo III do presente decreto-lei, do qual faz parte integrante, a fim de confirmar ou refutar a ocorrência suspeita;
b) Proibir a utilização e a circulação de plantas ou tubérculos de todas as colheitas, lotes ou remessas em que tenham sido colhidas amostras, excepto sob o seu controlo e desde que se tenha concluído que não existe qualquer risco identificável de dispersão do organismo prejudicial;
c) Adoptar medidas adicionais a fim de determinar a origem da ocorrência suspeita e evitar a dispersão do organismo prejudicial.
3 – Nos casos de ocorrência suspeita relativamente à qual existam riscos de contaminação dos materiais vegetais ou das águas superficiais de ou para outro Estado membro, a DGADR deve comunicar imediatamente, de acordo com o risco identificado, os organismos responsáveis dos Estados membros em causa, bem como a Comissão Europeia, dos dados relativos à citada ocorrência suspeita.
Artigo 6.º
Procedimentos no caso de confirmação da presença
do organismo prejudicial
1 – Sempre que a presença do organismo prejudicial seja confirmada através dos testes laboratoriais referidos no n.º 6 do artigo 3.º, os serviços de inspecção fitossanitária da DRA competente devem:
a) Zelar pelo cumprimento dos procedimentos estabelecidos no n.º 2 do anexo III;
b) No que respeita aos materiais vegetais:
i) Proceder a investigações para determinar a extensão e a ou as fontes primárias da contaminação, de acordo com o disposto no anexo IV do presente decreto-lei, do qual faz parte integrante, por meio de análises adicionais em conformidade com o disposto no n.º 6 do artigo 3.º, em, pelo menos, todos os lotes de batata-semente com uma relação clonal;
ii) Declarar contaminados os materiais vegetais, remessas e ou lotes em que tenha sido colhida a amostra, bem como as máquinas, veículos, recipientes, armazéns ou respectivas partes e quaisquer outros objectos, incluindo material de embalagem, que tenham estado em contacto com os materiais vegetais em que tenha sido colhida a amostra, declarar igualmente contaminados, quando for necessário, os campos, unidades de produção de culturas protegidas e locais de cultura em que tenham sido colhidos os materiais vegetais e de que provém a amostra, declarar também contaminados, no caso de amostras colhidas durante a época de cultura, os campos, locais de produção e, quando necessário, unidades de produção de culturas protegidas em que tenha sido colhida a amostra;
iii) Determinar, em conformidade com o disposto no n.º 1 do anexo V do presente decreto-lei, do qual faz parte integrante, a extensão da contaminação provável por contacto pré ou pós-colheita ou por relação de produção, irrigação ou relação clonal com a contaminação declarada; e
iv) Demarcar uma zona com base na declaração de contaminação, na determinação da extensão da contaminação provável e na possível dispersão do organismo prejudicial, em conformidade com o disposto na alínea i) do n.º 2 do anexo V;
c) Para as culturas de plantas hospedeiras diferentes das referidas na alínea anterior, quando considerarem que está em risco a produção dos materiais vegetais:
i) Proceder a investigações nos termos da subalínea i) da alínea anterior;
ii) Declarar contaminadas as plantas hospedeiras do organismo prejudicial em que tenha sido colhida a amostra; e
iii) Determinar a contaminação provável e demarcar uma zona nos termos das subalíneas iii) e iv) da alínea anterior, respectivamente, em relação à produção dos materiais vegetais;
d) Para as águas superficiais, incluindo resíduos líquidos de descarga de instalações de transformação industrial ou de embalagem que lidem com os materiais vegetais, e para solanáceas silvestres hospedeiras, quando considerarem que está em risco a produção dos materiais vegetais, por via da irrigação, aspersão ou inundação por águas superficiais:
i) Proceder a investigações, incluindo uma prospecção oficial, nos momentos adequados, em amostras de águas superficiais e de solanáceas silvestres hospedeiras, caso presentes, por forma a determinar a extensão da contaminação; e
ii) Declarar contaminadas as águas superficiais em que tenha ou tenham sido colhidas as amostras, na medida em que tal seja apropriado e no seguimento das investigações referidas na subalínea anterior; e
iii) Determinar a contaminação provável e demarcar uma zona, com base na declaração de contaminação, ao abrigo da subalínea anterior, e na possibilidade de dispersão do organismo prejudicial, tendo em conta o disposto no n.º 1 e na alínea ii) do n.º 2 do anexo V.
2 – A DGADR deve comunicar à Comissão Europeia e aos restantes Estados membros qualquer contaminação declarada:
a) Nos termos das subalíneas ii) da alínea b) e ii) da alínea d) do número anterior;
b) Dos pormenores respeitantes à demarcação da zona nos termos da subalínea iv) da alínea b) do número anterior;
c) Quando aplicável, dos pormenores respeitantes à demarcação da zona nos termos da subalínea iii) da alínea d) do número anterior, nos termos do disposto no n.º 3 do anexo V.
3 – A comunicação referida no número anterior é acompanhada da comunicação adicional prevista no n.º 4 do anexo V.
Artigo 7.º
Medidas de protecção fitossanitária subsequentes
1 – Os materiais vegetais declarados contaminados não podem ser plantados e sob controlo e aprovação dos serviços de inspecção fitossanitária da DRAP competente são sujeitos a um dos processos indicados no n.º 1 do anexo VI e do anexo VII do presente decreto-lei, do qual fazem parte integrante, em condições que garantam que não existe qualquer risco reconhecido de dispersão do organismo prejudicial.
2 – Os materiais vegetais declarados como provavelmente contaminados, incluindo os materiais vegetais que tenham sido considerados em risco, produzidos em locais de cultura declaradas como provavelmente contaminadas, não podem ser plantados e, sob controlo dos serviços de inspecção fitossanitária da DRAP competente, são utilizados de forma adequada ou eliminados conforme especificado no n.º 2 do anexo VI, em condições que garantam que não existe qualquer risco reconhecido de dispersão do organismo prejudicial.
3 – Toda a maquinaria, veículos, recipientes, armazéns ou respectivas partes e quaisquer outros objectos, incluindo o material de embalagem declarados contaminados, ou considerados como provavelmente contaminados, são destruídos ou descontaminados segundo métodos adequados conforme especificado no n.º 3 do anexo VI, sendo após a descontaminação esses objectos deixam de ser considerados contaminados.
4 – Sem prejuízo das medidas aplicadas nos termos dos números anteriores, na zona demarcada, são, também, aplicadas as medidas especificadas nos n.os 4.1 e 4.2 do anexo VI.
5 – Só é permitida a plantação de batata-semente desde que:
a) Sejam satisfeitas as exigências estabelecidas no Decreto-Lei n.º 154/2005, de 6 de Setembro;
b) A batata seja proveniente, em linha directa, de material obtido no âmbito de um programa oficialmente aprovado que tenha sido declarado isento do organismo prejudicial em testes oficiais ou controlados oficialmente, utilizando o método referido no n.º 6 do artigo 4.º
6 – Os testes referidos na alínea b) do número anterior devem ser realizados:
a) Quando tiver sido comprovada a presença do organismo prejudicial na própria produção de batata-semente:
i) Através de análises de todo o material de propagação anterior, incluindo a selecção clonal inicial, e de análises sistemáticas de todos os clones de batata-semente de base; ou
ii) Quando tiver sido determinado que não existe relação clonal inicial, através de análises de todos os clones de batata-semente de base ou de material de propagação anterior, incluindo a selecção clonal inicial;
b) Nos restantes casos ou em todas as plantas de selecção clonal inicial ou em amostras representativas da batata-semente base ou de material de propagação anterior.
Artigo 8.º
Notificação das medidas fitossanitárias
As medidas de protecção fitossanitária determinadas e mandadas aplicar são objecto de notificações oficiais emanadas das DRAP, dirigidas às pessoas singulares e colectivas envolvidas.
Artigo 9.º
Encargos dos operadores económicos
Os encargos resultantes da aplicação das medidas de protecção fitossanitária referidas no número anterior são suportados pelos respectivos operadores económicos.
Artigo 10.º
Proibição
É proibida a posse e manuseamento do organismo prejudicial.
Artigo 11.º
Derrogações
Para fins experimentais ou científicos e trabalhos de selecção varietal, a DGADR pode autorizar a não execução do disposto nos n.os 1 a 4 do artigo 7.º e no artigo 10.º, para efeitos de aplicação do Decreto-Lei n.º 91/98, de 14 de Abril, que estabelece as condições pelas quais determinados organismos prejudiciais, vegetais, produtos vegetais e outros materiais podem ser introduzidos ou circular na Comunidade ou em zonas protegidas para fins experimentais ou científicos e trabalhos de selecção de variedades.
CAPÍTULO III
Regime contra-ordenacional
Artigo 12.º
Contra-ordenações
1 – As seguintes infracções constituem contra-ordenações puníveis com coima cujo montante mínimo é de (euro) 100 e máximo de (euro) 3740 ou mínimo de (euro) 250 e máximo de (euro) 44890, consoante o agente seja pessoa singular ou colectiva:
a) A omissão do dever de informação previsto no artigo 4.º;
b) O não cumprimento das medidas de protecção fitossanitária determinadas e mandadas aplicar ao abrigo do artigo 8.º e em violação do disposto nos artigos 5.º e 7.º;
c) O não cumprimento dos encargos financeiros resultantes da aplicação das medidas de protecção fitossanitária a aplicar ao abrigo do artigo 8.º, em violação do disposto no artigo 9.º;
d) A posse e o manuseamento do organismo prejudicial, em violação do disposto no artigo 10.º
2 – A tentativa e a negligência são puníveis, sendo nesse caso reduzidos para metade os limites mínimos e máximos referidos no número anterior.
Artigo 13.º
Sanções acessórias
1 – Em função da gravidade da infracção e da culpa do agente, podem ser aplicadas, simultaneamente com as coimas, as seguintes sanções acessórias:
a) Perda de objectos pertencentes ao agente;
b) Interdição do exercício de profissões ou actividades cujo exercício dependa de título público ou de autorização ou de homologação de autoridade pública;
c) Privação do direito a subsídio ou benefício outorgado por entidades ou serviços públicos;
d) Privação do direito de participar em feiras ou mercados;
e) Encerramento de estabelecimento cujo funcionamento esteja sujeito a autorização de autoridade administrativa;
f) Suspensão de autorizações.
2 – As sanções previstas no número anterior têm a duração máxima de um ano.
3 – No caso de uma conduta contra-ordenacional ter ocasionado um grave risco de propagação do organismo prejudicial, deve ser dada publicidade à decisão condenatória definitiva de aplicação da coima, mediante a afixação de editais na sede da DRA da área onde foi praticada a infracção.
Artigo 14.º
Processos de contra-ordenação
Sem prejuízo das competências atribuídas por lei às autoridades policiais e fiscalizadoras, o levantamento dos autos e a instrução dos processos de contra-ordenação são da competência da DRAP da região em cuja área foi praticada a contra-ordenação, competindo ao director-geral da Agricultura e Desenvolvimento Rural a aplicação das coimas e sanções acessórias.
Artigo 15.º
Produto das coimas
O produto das coimas reverte:
a) Em 10% para a entidade que levantou o auto de contra-ordenação;
b) Em 10% para a entidade que instruiu o processo;
c) Em 20% para a entidade que aplicou a coima;
d) Em 60% para o Estado.
CAPÍTULO IV
Disposições finais
Artigo 16.º
Aplicação às Regiões Autónomas
1 – Sem prejuízo das competências atribuídas à DGADR na qualidade de autoridade fitossanitária nacional, as competências atribuídas pelo presente decreto-lei às DRAP são exercidas nas Regiões Autónomas dos Açores e da Madeira pelos organismos dos departamentos regionais competentes.
2 – As competências previstas no artigo 14.º são exercidas nas Regiões Autónomas dos Açores e da Madeira pelos organismos definidos pelos órgãos de governo próprio.
3 – As percentagens previstas no artigo 15.º provenientes das coimas aplicadas nas Regiões Autónomas dos Açores e da Madeira constituem receita própria de cada uma delas.
Artigo 17.º
Norma revogatória
É revogado o Decreto-Lei n.º 494/99, de 18 de Novembro.
Artigo 18.º
Remissão
Todas as referências feitas para o decreto-lei que agora se revoga consideram-se feitas para o presente decreto-lei.
Visto e aprovado em Conselho de Ministros de 3 de Maio de 2007. – José Sócrates Carvalho Pinto de Sousa – Luís Filipe Marques Amado – Fernando Teixeira dos Santos – Alberto Bernardes Costa – Francisco Carlos da Graça Nunes Correia – Manuel António Gomes de Almeida de Pinho – Jaime de Jesus Lopes Silva.
Promulgado em 11 de Junho de 2007.
Publique-se.
O Presidente da República, ANÍBAL CAVACO SILVA.
Referendado em 14 de Junho de 2007.
O Primeiro-Ministro, José Sócrates Carvalho Pinto de Sousa.
ANEXO I
SECÇÃO I
Lista de vegetais hospedeiros de Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.
1 – Plantas (incluindo tubérculos, com excepção da semente verdadeira, de Solanum tuberosum L. (Batata).
2 – Plantas, com excepção de frutos e sementes de Lycopersicon Lycopersicum (L.) Karsten ex Farw. (Tomate).
SECÇÃO II
Prospecções
1 – As prospecções oficiais referidas no n.º 3 do artigo 3.º, são baseadas na biologia do organismo prejudicial e nos sintomas de produção específica do País, devendo incluir:
1.1 – No caso da batata:
a) Em alturas apropriadas, inspecção visual da cultura em desenvolvimento e ou colheita de amostras de batata-semente e de batata consumo durante a época de cultura ou em armazém, sendo que essas amostras são sujeitas a uma inspecção visual oficial ou oficialmente controlada, com corte dos tubérculos; e
b) No caso da batata-semente e, quando apropriado, da batata consumo, análises laboratoriais oficiais ou oficialmente controladas, utilizando o método constante do anexo II.
1.2 – No caso do tomate, inspecção visual em alturas apropriadas, pelo menos da cultura em desenvolvimento de plantas destinadas a replantação para utilização profissional.
2 – A comunicação das prospecções oficiais, a que se refere o n.º 7 do artigo 3.º, deve incluir:
2.1 – No caso de prospecções em batata:
a) Estimativa da superfície total de cultura de batata-sememte e de batata consumo, em hectares;
b) Descriminação por categoria de semente e calibre e, quando apropriado por região;
c) Número e data das amostras colhidas para análise;
d) Número de inspecções visuais da cultura;
e) Número (e dimensão da amostra) de inspecções visuais de tubérculos.
2.2 – No caso de prospecções, pelo menos na cultura em desenvolvimento, de plantas de tomateiro destinadas a replantação para utilização profissional:
a) Estimativa do número total de plantas;
b) Número de inspecções visuais.
2.3 – No caso de prospecções noutras plantas hospedeiras, incluindo solanáceas silvestres hospedeiras:
a) Espécie;
b) Número e data das amostras colhidas;
c) Área/rio, consoante o caso, em que foram colhidas as amostras;
d) Método analítico.
2.4 – No caso de prospecções em águas e descargas de resíduos líquidos provenientes de instalações de transformação industrial ou de embalagem:
a) Número e data das amostras colhidas;
b) Área/rio/situação das instalações, consoante o caso, em que foram colhidas as amostras;
c) Método analítico.
ANEXO II
Esquema de ensaio para diagnóstico, detecção e identificação de Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., para efeitos do presente anexo designada por R. solanacearum.
Âmbito do esquema de ensaio
O esquema de ensaio apresentado descreve os vários procedimentos envolvidos:
i) No diagnóstico do pus em tubérculos de batateira e de mal murcho em plantas de batateira, de tomateiro e outras plantas hospedeiras;
ii) Na detecção de R. solanacearum em amostras de tubérculos de batateira, em plantas de batateira, de tomateiro e outras plantas hospedeiras, em água e no solo;
iii) Na identificação de R. solanacearum.
Princípios gerais:
Nos apêndices são apresentados os protocolos optimizados para os diversos métodos, reagentes validados e pormenores respeitantes à preparação dos materiais para realização dos testes e dos controlos. No apêndice n.º 1 é fornecida uma lista dos laboratórios incluídos na optimização e validação de protocolos.
Uma vez que os protocolos envolvem a detecção de um organismo de quarentena e incluem a utilização de culturas viáveis de R. solanacearum como materiais de controlo, é necessário realizar os procedimentos em condições de quarentena adequadas, em instalações com sistemas apropriados de eliminação de resíduos e possuindo as licenças adequadas, emitidas pelas autoridades oficiais competentes em matéria de quarentena fitossanitária.
Os parâmetros dos ensaios devem garantir a detecção consistente e reprodutível de níveis de R. solanacearum nos limiares estabelecidos para os métodos seleccionados.
É imperiosa a preparação rigorosa de controlos positivos.
A realização dos ensaios de acordo com os limiares exigidos implica igualmente uma regulação, manutenção e calibração correctas do equipamento, uma manipulação e conservação cuidadosas dos reagentes e estabelecimento de todas as medidas destinadas a evitar contaminações entre amostras, por exemplo, a separação de controlos positivos das amostras a testar. Devem ser aplicadas normas de controlo de qualidade a fim de evitar, nomeadamente, erros administrativos, em especial no tocante à rotulagem e à documentação.
Uma ocorrência suspeita, conforme referido no n.º 1 do artigo 5.º do presente decreto-lei, implica um resultado positivo nos testes de diagnóstico ou de rastreio efectuados numa amostra, conforme especificado nos fluxogramas a seguir indicados. Um primeiro teste de rastreio positivo (teste IF, PCR/FISH, isolamento selectivo) deve ser confirmado por um segundo teste de rastreio baseado num princípio biológico diferente.
Caso o primeiro teste de rastreio seja positivo, suspeita-se, então, de contaminação por R. solanacearum, devendo proceder-se a um segundo teste de rastreio. Caso o segundo teste de rastreio seja positivo, é confirmada a suspeita (ocorrência suspeita), devendo prosseguir-se a verificação de acordo com o esquema. Caso o segundo teste de rastreio seja negativo, considera-se então que a amostra não está contaminada por R. solanacearum.
A presença confirmada, conforme referido no no n.º 1 do artigo 6.º do presente decreto-lei, implica o isolamento e a identificação de uma cultura pura de R. solanacearum com confirmação de patogenicidade.
SECÇÃO I
Aplicação do esquema de ensaio
1 – Esquema para o diagnóstico do pus ou mal murcho (R. solanacearum) em tubérculos de batateira e em plantas de batateira, tomateiro ou outras plantas hospedeiras com sintomas:
O procedimento laboratorial destina-se a tubérculos de batateira e a plantas com sintomas típicos ou suspeitos de pus ou mal murcho. Implica um teste rápido de rastreio, isolamento do patogéneo a partir do tecido vascular infectado num meio de cultura (selectivo) e, em caso de resultado positivo, identificação da cultura como R. solanacearum.
(ver documento original)
2 – Esquema para detecção e identificação de R. solanacearum em amostras de tubérculos de batateira assintomáticos:
Princípio:
O procedimento laboratorial destina-se a detectar infecções latentes em tubérculos de batateira. Um resultado positivo em, pelo menos, dois testes de rastreio (3), com base em princípios biológicos diferentes, deve ser complementado com o isolamento do patogéneo, seguido, em caso de isolamento de colónias típicas, de confirmação da identificação da cultura pura como sendo R. solanacearum. Um resultado positivo em apenas um dos testes de rastreio não é suficiente para considerar a amostra suspeita.
Os testes de rastreio e os testes de isolamento devem permitir detectar 10(elevado a 3) a 10(elevado a 4) células por ml de sedimento ressuspenso, incluídos como controlos positivos em cada série de testes.
(ver documento original)
3 – Esquema para detecção e identificação de R. solanacearum em amostras de plantas assintomáticas de batateira, tomateiro ou outras plantas hospedeiras:
(ver documento original)
SECÇÃO II
Métodos pormenorizados de detecção de R. Solanacearum em tubérculos de batateira e em plantas de batateira, tomateiro ou outras plantas hospedeiras com sintomas de pus ou mal murcho
1 – Sintomas (ver http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main):
1.1 – Sintomas em batateira:
Planta de batateira:
Na fase inicial de infecção no campo, verifica-se uma murchidão das folhas na parte superior da planta a temperaturas elevadas e durante o dia, com recuperação à noite. Na fase inicial de murchidão, as folhas mantêm-se verdes mas, posteriormente, desenvolve-se uma clorose seguida de necrose. Observa-se também epinastia. A murchidão de um rebento ou de toda a planta torna-se rapidamente irreversível, resultando no colapso e na morte da planta. O tecido vascular dos caules de plantas afectadas cortados transversalmente apresenta-se necrosado e um exsudado bacteriano de cor esbranquiçada emerge da superfície cortada ou pode ser extraído apertando o caule entre os dedos. Quando um caule cortado é colocado verticalmente em água, observa-se a exsudação de um líquido viscoso a partir dos feixes vasculares.
Tubérculo de batateira:
Os tubérculos de batateira têm que ser cortados transversalmente junto do hilo (extremidade do estolho) ou longitudinalmente sobre a extremidade do estolho. Na fase inicial de infecção, verifica-se uma coloração amarela vítrea ou castanha clara no anel vascular, pelo qual emerge espontaneamente, após alguns minutos, um exsudado bacteriano de cor creme clara. Mais tarde, a descoloração vascular assume um tom castanho mais nítido e a necrose pode alastrar ao parênquima. Nas fases mais avançadas, a infecção progride a partir do hilo e dos «olhos», nos quais se pode manifestar exsudação bacteriana que origina a adesão de partículas de terra. Podem apresentar-se lesões na epiderme de cor vermelha acastanhada, em ligeira depressão, por colapso interno dos tecidos vasculares. Nas fases avançadas da doença, é comum o desenvolvimento de podridões moles secundárias causadas por fungos ou bactérias.
1.2 – Sintomas no tomateiro:
Planta de tomateiro:
Os primeiros sintomas visíveis são o aspecto flácido das folhas mais jovens. Em condições ambientais favoráveis ao patogéneo (temperatura do solo de 25ºC, humidade saturada), surge dentro de poucos dias a epinastia e a murchidão de um lado ou de toda a planta, conduzindo ao total colapso da planta. Em condições menos favoráveis (temperatura do solo inferior a 21ºC), observa-se uma menor murchidão, mas pode desenvolver-se no caule um grande número de raízes adventícias. Podem observar-se manchas hidrópicas alongadas a partir da base do caule, que evidenciam a necrose do sistema vascular. Quando o caule é cortado transversalmente, os seus tecidos vasculares apresentam uma coloração acastanhada e exsudam gotas de líquido viscoso branco ou amarelado, que contêm células bacterianas.
1.3 – Sintomas noutros hospedeiros:
Plantas de Solanum dulcamara e S. nigrum:
Em condições naturais, os sintomas de murchidão são raramente observados nestas infestantes hospedeiras, a menos que as temperaturas do solo ultrapassemos 25ºC ou que os níveis de inóculo sejam extremamente elevados (por exemplo, no caso de S. nigrum que cresce junto de plantas de batateira ou de tomateiro doentes). Quando efectivamente ocorre a murchidão, os sintomas são iguais aos descritos para o tomateiro. As plantas de S. dulcamara que não apresentam murchidão e com os caules e raízes imersos em água podem apresentar uma coloração castanha clara dos tecidos vasculares em secções transversais da base do caule ou de outras partes do caule que se encontrem submersas. Mesmo na ausência de sintomas de murchidão, pode manifestar-se a presença de exsudado bacteriano a partir de cortes de tecido vascular ou observar-se esse exsudado se o caule, cortado transversalmente, for colocado verticalmente em água.
2 – Testes rápidos de rastreio:
Os testes rápidos de rastreio podem facilitar o diagnóstico preliminar, mas não são essenciais. Utilizar um ou mais dos seguintes testes validados:
2.1 – Teste de exsudação do caule (ver n.º 1 da parte A da secção VI.).
2.2 – Detecção de grânulos de poli-â-hidroxibutirato (PHB):
Os grânulos característicos de PHB nas células de R. solanacearum são visualizados através da coloração com azul de Nilo A ou com negro de Sudão de esfregaços de exsudado bacteriano provenientes de tecido vegetal infectado fixados pelo calor numa lâmina de microscópio (ver n.º 2 da parte A da secção VI).
2.3 – Testes serológicos de aglutinação (ver n.º 3 da parte A da secção VI.).
2.4 – Outros testes:
Outros testes rápidos de rastreio considerados apropriados são o teste IF (ver n.º 5 da parte A da secção VI), o teste FISH (ver n.º 7 da parte A da secção VI), os testes ELISA (ver n.º 8 da parte A da secção VI) e os testes PCR (ver n.º 6 da parte A da secção VI).
3 – Isolamento:
a) Retirar o exsudado ou secções do tecido necrosado do anel vascular do tubérculo ou da zona vascular do caule da planta de batateira, tomateiro ou outras plantas hospedeiras com sintomas de murchidão. Efectuar uma suspensão num pequeno volume de água destilada esterilizada ou de tampão fosfato 50 mM (apêndice n.º 4) e deixar em repouso durante 5 a 10 minutos;
b) Preparar uma série de diluições decimais da suspensão;
c) Transferir 50-100 (mi)l da suspensão para um meio nutritivo geral (NA, YPGA ou SPA, ver apêndice n.º 2) e ou para o meio de tetrazólio de Kelman (apêndice n.º 2) e ou para um meio selectivo validado (por exemplo, SMSA, ver apêndice n.º 2). Espalhar ou efectuar um reticulado com uma técnica adequada de diluição em placas. Se necessário, preparar um conjunto separado de placas com uma suspensão diluída de células de R. solanacearum Biovar 2 como controlo positivo;
d) Incubar as placas durante 2 a 6 dias a 28ºC:
Em meios nutritivos gerais, os isolados virulentos de R. solanacearum produzem colónias de cor branco-pérola, achatadas, irregulares e fluidas, exibindo muitas vezes espirais características no centro. Formas avirulentas de R. solanacearum apresentam pequenas colónias butirosas redondas e não fluidas de coloração esbranquiçada;
Nos meios de tetrazólio de Kelman e SMSA, as espirais são de cor vermelha viva. As formas avirulentas de R. solanacearum apresentam pequenas colónias butirosas redondas e não fluidas que são completamente vermelho-escuras.
4 – Testes de identificação de R. solanacearum:
Testes para confirmar a identidade de presumíveis isolados de R. solanacearum são descritos na parte B da secção VI.
SECÇÃO III
1 – Métodos pormenorizados de detecção e identificação de R. solanacearum em amostras de tubérculos de batateira assintomáticos:
1.1 – Preparação da amostra:
Nota. – A dimensão normal da amostra é de 200 tubérculos por teste. Uma amostragem mais intensiva exige a realização de mais testes em amostras desta dimensão. Uma amostra com um maior número de tubérculos conduzirá à incapacidade ou a uma maior dificuldade de interpretação dos resultados. Contudo, este procedimento pode ser aplicado a amostras com menos de 200 tubérculos, sempre que este número de tubérculos não se encontre disponível.
A validação de todos os métodos de detecção abaixo descritos tem por base a análise de amostras constituídas por 200 tubérculos.
O extracto de batata descrito em seguida pode também ser utilizado para a detecção da bactéria Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, responsável pela podridão anelar da batateira.
Pré-tratamento opcional antes da preparação da amostra:
a) Incubação de amostras a uma temperatura de 25-30 C durante um período de até 2 semanas, para favorecer a multiplicação de populações de R. solanacearum;
b) Lavar os tubérculos. Utilizar desinfectantes (compostos de cloro sempre que se utilizar o teste PCR para destruir ADN de organismos saprófitas) e detergentes adequados entre cada amostra. Secar os tubérculos ao ar. Este procedimento de lavagem é particularmente útil (mas não obrigatório) para amostras que apresentem um excesso de terra e quando se pretende realizar um teste PCR ou um isolamento directo.
1.1.1 – Remover a epiderme na zona do hilo de cada tubérculo com um bisturi ou faca de cortar legumes, limpos e desinfectados, de forma que o tecido vascular fique visível. Retirar cuidadosamente um pequeno cone de tecido vascular na zona do hilo, reduzindo ao mínimo a quantidade de tecido não vascular (ver sítio web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).
Nota. – Pôr de lado quaisquer tubérculos (com podridões) que exibam sintomas suspeitos de pus analisá-los separadamente.
Caso se observem sintomas suspeitos de pus durante a remoção do cone da zona do hilo, deve proceder-se a uma inspecção visual do tubérculo em questão e este deverá ser cortado próximo do hilo. Qualquer tubérculo cortado exibindo sintomas suspeitos deve ser mantido durante, pelo menos, dois dias à temperatura ambiente, no sentido de permitir a suberização, e em seguida armazenado numa área refrigerada (entre 4 a 10ºC) em condições de quarentena adequadas. Todos os tubérculos, incluindo os que apresentam sintomas suspeitos, devem ser conservados de acordo com o anexo III.
1.1.2 – Colocar os cones dos hilos em recipientes descartáveis não utilizados que possam ser fechados e ou selados (caso os recipientes sejam reutilizados devem ser cuidadosamente limpos e desinfectados com compostos de cloro). Os cones dos hilos devem ser, de preferência, processados de imediato. Se tal não for possível, devem ser mantidos no recipiente, sem adição de tampão, em local refrigerado durante, no máximo, 72 horas, ou 24 horas à temperatura ambiente.
Processar os cones dos hilos de acordo com um dos seguintes procedimentos:
a) Cobrir os cones com um volume suficiente (cerca de 40 ml) de tampão de extracção (apêndice n.º 4) e colocá-los num agitador rotativo (50-100 rpm) durante 4 horas a uma temperatura inferior a 24ºC, ou durante 16-24 horas refrigerados; ou
b) Homogeneizar os cones com um volume suficiente (cerca de 40 ml) de tampão de extracção (apêndice n.º 4) num misturador (por exemplo, Waring Blender ou Ultra Thurrax) ou por esmagamento num saco de maceração descartável selado (por exemplo, Stomacher ou Bioreba, em polietileno resistente, de 150 mm x 250 mm, esterilizado por radiação) utilizando um macete de borracha ou um instrumento de trituração adequado (por exemplo, Homex).
Nota. – O risco de contaminação cruzada das amostras é elevado quando estas são homogeneizadas com recurso a um misturador. Tomar as precauções necessárias para evitar a formação de aerossóis ou derrames durante o processo de extracção. Assegurar-se de que as lâminas e os recipientes do misturador utilizados para cada amostra foram recentemente esterilizados. Caso se utilize o teste PCR, evitar a contaminação por ADN dos recipientes ou instrumento de trituração. Sempre que se utilize o teste PCR, recomenda-se a trituração em sacos descartáveis e a utilização de tubos descartáveis.
1.1.3 – Decantar o sobrenadante. Caso se encontre excessivamente turvo, clarificar através de centrifugação a baixa velocidade (a não mais de 180 g durante 10 minutos a uma temperatura entre 4 e 10ºC) ou de filtração por vácuo (40-100 (mi)m), lavando o filtro com tampão de extracção adicional (10 ml).
1.1.4 – Concentrar a fracção bacteriana por centrifugação a 7000 g durante 15 minutos (ou 10000 g durante 10 minutos) a uma temperatura entre 4 e 10ºC e desprezar o sobrenadante sem perturbar o sedimento.
1.1.5 – Ressuspender o sedimento em 1,5 ml de tampão de ressuspensão (apêndice n.º 4). Utilizar 500 (mi)l para R. solanacearum, 500 (mi)l para Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus e 500 (mi)l para fins de referência. Adicionar glicerol esterilizado até obter uma concentração final de 10-25% (v/v) aos 500 (mi)l das alíquotas de referência e à alíquota remanescente da amostra em estudo; agitar em vortex e armazenar entre -16 e -24ºC (semanas) ou entre 68 e 86ºC (meses). Manter a alíquota remanescente da amostra em estudo a uma temperatura entre 4 e 10ºC durante o período de ensaio.
Não se aconselha a congelação e descongelação repetidas.
Caso seja necessário transportar o extracto, garantir a entrega numa caixa refrigerada num prazo de 24 a 48 horas.
1.1.6 – É indispensável que todas as amostras e controlos positivos de R. solanacearum sejam tratados separadamente para evitar contaminações. O mesmo se aplica às lâminas de imunofluorescência e a todos os testes.
1.2 – Ensaio:
Ver fluxograma e descrição dos testes e protocolos optimizados nos respectivos apêndices:
Isolamento selectivo (ver n.º 4 da parte A da secção VI);
Teste IF (ver n.º 5 da parte A da secção VI);
Testes PCR (ver n.º 6 da parte A da secção VI);
Teste FISH (ver n.º 7 da parte A da secção VI);
Testes ELISA (ver n.º 8 da parte A da secção VI);
Bioensaio (ver n.º 9 da parte A da secção VI).
2 – Métodos pormenorizados de detecção e identificação de R. solanacearum em amostras de plantas assintomáticas de batateira, tomateiro ou outras plantas hospedeiras:
2.1 – Preparação da amostra:
Nota. – Para a detecção de populações latentes de R. solanacearum, é aconselhável a análise de amostras compostas. O procedimento pode ser aplicado convenientemente a amostras compostas contendo até 200 partes de caule. Sempre que forem realizadas prospecções, estas devem basear-se numa amostra estatisticamente representativa da população de plantas em estudo.
2.1.1 – Recolher segmentos de caule de 1-2 cm num recipiente esterilizado fechado, de acordo com os seguintes procedimentos de amostragem:
Plântulas de tomateiro de viveiro:
Com uma faca limpa e desinfectada, remover um segmento de 1 cm da base de cada caule, imediatamente acima do nível do solo.
Plantas de tomateiro cultivadas no campo ou em estufa:
Com uma faca limpa e desinfectada, remover o rebento lateral inferior de cada planta, cortando-o imediatamente acima do ponto de junção com o caule principal. Remover o segmento inferior de 1 cm de cada rebento lateral.
Outros hospedeiros:
Com uma faca ou uma tesoura de poda limpas e desinfectadas, remover um segmento de 1 cm da base de cada caule, imediatamente acima do nível do solo. No caso da S. dulcamara ou de outras plantas hospedeiras aquáticas, retirar secções de 1-2 cm dos caules ou estolhos que se encontrem submersos com raízes aquáticas.
Ao colher amostras de um determinado local, recomenda-se a análise de uma amostra estatisticamente representativa de, pelo menos, 10 plantas de cada potencial hospedeiro infestante por ponto de amostragem. A detecção do patogéneo será mais fiável no final da Primavera, no Verão e no Outono, embora se possam detectar infecções naturais durante todo o ano em S. dulcamara perene que cresce em cursos de água. Alguns hospedeiros conhecidos incluem plantas da batateira espontâneas (zorras), S. dulcamara, S. nigrum, Datura stramonium e outros membros da família Solanaceae. Outros hospedeiros são o Pelargonium spp. e Portulaca oleracea. Algumas espécies de infestantes europeias que podem ser potenciais hospedeiros de populações de R. solanacearum Biovar 2/Raça 3 nas raízes e ou rizosfera, em condições ambientais específicas, incluem Atriplex hastata, Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp., Rumex spp., Silene alba, S. nutans., Tussilago farfarra e Urtica dioica.
Nota. – O exame visual dos sintomas internos (necrose vascular ou produção de exsudado bacteriano) pode ser feito nesta fase. Pôr de lado qualquer segmento de caule que exiba sintomas e testá-lo separadamente (ver secção II).
2.1.2 – Desinfectar rapidamente os segmentos de caule com etanol a 70% e secar imediatamente com papel absorvente. Em seguida, processar os segmentos de caule de acordo com um dos seguintes procedimentos:
a) Cobrir os segmentos com um volume suficiente (cerca de 40 ml) de tampão de extracção (apêndice n.º 4) e colocá-los num agitador rotativo (50-100 rpm) durante 4 horas a uma temperatura inferior a 24ºC ou durante 16-24 horas em local refrigerado; ou
b) Processar imediatamente, esmagando os segmentos num saco de maceração resistente (por exemplo, Stomacher ou Bioreba) com um volume adequado de tampão de extracção (apêndice n.º 4), com recurso a um macete de borracha ou um instrumento de trituração adequado (por exemplo, Homex). Se tal não for possível, armazenar os segmentos de caule refrigerados durante, no máximo, 72 horas, ou 24 horas à temperatura ambiente.
2.1.3 – Decantar o sobrenadante após 15 minutos de repouso.
2.1.4 – Não é normalmente necessário proceder à clarificação do extracto ou à concentração da fracção bacteriana, mas estes objectivos podem alcançar-se através de filtração e ou centrifugação, tal como descrito nos n.os 1.1.3 a 1.1.5 da secção III.
2.1.5 – Dividir o extracto puro ou concentrado da amostra em duas partes iguais. Manter uma metade a uma temperatura de 4 a 10ºC durante a realização dos testes e armazenar a outra metade com 10-25% (v/v) de glicerol esterilizado a uma temperatura compreendida entre 16 e 24ºC (semanas) ou 68 e 86ºC (meses), caso seja necessário proceder a mais testes.
2.2 – Ensaio:
Ver fluxograma e descrição dos testes e protocolos optimizados nos respectivos apêndices:
Isolamento selectivo (ver n.º 4 da parte A da secção VI;
Teste IF (ver n.º 5 da parte A da secção VI);
Testes PCR (ver n.º 6 da parte A da secção VI);
Teste FISH (ver n.º 7 da parte A da secção VI);
Testes ELISA (ver n.º 8 da parte A da secção VI);
Bioensaio (ver n.º 9 da parte A da secção VI).
SECÇÃO IV
1 – Esquema para detecção e identificação de R. solanacearum em água:
(ver documento original)
2 – Métodos de detecção e identificação de R. solanacearum em água:
Princípio:
O esquema de detecção validado descrito nesta secção é aplicável à detecção do patogéneo em amostras de águas superficiais, podendo também ser aplicado a amostras de efluentes de transformação de batata ou de esgotos. Contudo, é importante notar que a sensibilidade de detecção esperada irá variar consoante o substrato. A sensibilidade do teste de isolamento é afectada pelas populações de bactérias saprófitas competidoras, normalmente muito superiores nos efluentes de transformação de batata e de esgotos do que nas águas superficiais. Embora se espere que o esquema a seguir descrito detecte, pelo menos, 10(elevado a 3) células por litro nas águas superficiais, a sensibilidade de detecção nos efluentes de transformação de batata e de esgotos deverá ser bastante inferior. Por isso, recomenda-se que se testem os efluentes depois de quaisquer tratamentos de purificação (por exemplo, sedimentação ou filtração), durante os quais os níveis populacionais de bactérias saprófitas diminuem. Devem considerar-se as limitações em termos de sensibilidade do esquema de ensaio, ao avaliar a fiabilidade de eventuais resultados negativos obtidos. Embora este esquema tenha sido usado com êxito em prospecções para determinar a presença ou ausência do patogéneo em águas superficiais, devem reconhecer-se as limitações do seu uso em prospecções semelhantes de efluentes de transformação de batata ou de esgotos.
2.1 – Preparação da amostra:
Nota. – A detecção de R. solanacearum em águas superficiais é mais fiável no final da Primavera, no Verão e no Outono, quando a temperatura da água é superior a 15ºC.
A realização de amostragens repetidas em diferentes momentos do período mencionado anteriormente em pontos de amostragem designados aumentará a fiabilidade da detecção pela redução dos efeitos da variação climática.
Ter em conta os efeitos das fortes precipitações e a geografia do curso de água, para evitar os efeitos de uma diluição exagerada, que poderão camuflar a presença do patogéneo.
Recolher amostras de águas superficiais na proximidade de plantas hospedeiras, caso estas existam.
2.1.1 – Nos pontos de amostragem seleccionados, recolher amostras de água enchendo tubos ou frascos esterilizados e descartáveis, se possível, a uma profundidade superior a 30 cm e a menos de 2 m da margem. Para os efluentes da transformação de batata e de esgotos, recolher amostras no ponto de descarga dos efluentes. Recomenda-se que o volume das amostras não deverá ultrapassar os 500 ml por ponto de amostragem. Caso se prefiram amostras mais pequenas, é aconselhável recolher amostras, pelo menos, três vezes por ponto de amostragem, devendo cada amostra ser constituída por duas subamostras duplicadas de, pelo menos, 30 ml cada. Para prospecções mais intensivas, seleccionar pelo menos três pontos de amostragem por cada 3 km de curso de água e certificar-se de que são também recolhidas amostras dos afluentes que entram no curso de água.
2.1.2 – Transportar as amostras refrigeradas 4-10ºC) e no escuro e testá-las no prazo de 24 horas.
2.1.3 – Caso seja necessário, a fracção bacteriana pode ser concentrada por um dos seguintes métodos:
a) Centrifugar subamostras de 30-50 ml a 10000 g durante 10 minutos (ou a 7000 g durante 15 minutos), de preferência a uma temperatura entre 4 e 10ºC, desprezar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 1 ml de tampão de ressuspensão (apêndice n.º 4); ou
b) Filtração com membrana (dimensão mínima do poro de 0,45 (mi)m), seguida de lavagem do filtro com 5-10 ml de tampão de ressuspensão e recuperação das suspensões resultantes da lavagem. Este método é adequado para volumes maiores de água contendo um reduzido número de saprófitas;
Em geral, não se aconselha a concentração para amostras de efluentes de transformação de batata ou de esgotos, dado que a existência de níveis populacionais mais elevados de bactérias saprófitas competidoras inibirá a detecção da R. solanacearum.
2.2 – Ensaio:
Ver fluxograma e descrição dos testes nos respectivos apêndices.
SECÇÃO V
1 – Esquema para detecção e identificação de R. solanacearum no solo:
(ver documento original)
2 – Métodos de detecção e identificação de R. solanacearum no solo:
Princípios:
O esquema de detecção validado descrito nesta secção é aplicável à detecção do patogéneo em amostras de solo, embora possa também ser usado para análise de amostras de resíduos sólidos de transformação de batata ou de lamas de depuração. Deve notar-se, porém, que estes métodos não são suficientemente sensíveis para garantir a detecção de populações baixas e/ou dispersas de modo irregular de R. Solanacearum que podem ocorrer em amostras naturalmente contaminadas desses substratos.
Devem considerar-se as limitações em termos de sensibilidade deste esquema de ensaio, ao avaliar a fiabilidade dos resultados negativos obtidos e também quando usado em prospecções para determinar a presença ou ausência do patogéneo em solos ou em lamas. O teste mais fiável para detectar a presença do patogéneo num campo consiste em plantar um hospedeiro susceptível e controlá-lo para detectar uma eventual infecção, mas, mesmo com este método, não serão detectados os baixos níveis de contaminação.
2.1 – Preparação da amostra:
2.1.1 – A recolha de amostras de solo de um campo deve seguir os princípios comuns usados para a amostragem de nemátodos. Recolher 0,5-1 kg de solo por amostra de 60 locais por cada 0,3 ha, a uma profundidade de 10-20 cm (ou numa grelha de 7 x 7 metros). Caso se suspeite de presença do patogéneo, aumentar o número de pontos de recolha para 120 por 0,3 ha. Manter as amostras a 12-15ºC antes do seu processamento. Para as amostras de resíduos provenientes da transformação de batata ou de lamas de depuração, recolher um total de 1 kg dos locais representativos do volume total dos resíduos e lamas a testar. Misturar bem cada uma das amostras antes de efectuar os testes.
2.1.2 – Dispersar subamostras de 10-25 g de solos, resíduos sólidos de transformação de batata ou lamas num agitador rotativo (250 rpm) em 60-150 ml de tampão de extracção (apêndice n.º 4) durante um período máximo de duas horas. Se necessário, pode auxiliar-se a dispersão mediante adição de 0,02% de Tween-20 e de 10-20 g de cascalho esterilizados.
2.1.3 – Manter a suspensão a 4ºC durante os testes.
2.2 – Ensaio:
Ver fluxograma e descrição dos testes nos respectivos apêndices.
SECÇÃO VI
Protocolos optimizados para detecção e identificação de R. Solanacearum
PARTE A
Testes de diagnóstico e detecção
1 – Teste de exsudação do caule:
A presença de R. solanacearum em caules de batateira, tomateiro ou outras plantas hospedeiras com sintomas de murchidão pode ser avaliada através de um simples teste inicial: cortar o caule imediatamente acima do nível do solo. Suspender a superfície cortada num tubo de ensaio com água límpida. Passados alguns minutos, procurar observar uma exsudação bacteriana espontânea característica a partir dos feixes vasculares.
2 – Detecção de grânulos de poli-â-hidroxibutirato:
1) Preparar um esfregaço do exsudado bacteriano proveniente do tecido infectado ou de uma cultura de 48 horas em meio YPGA ou SPA (apêndice n.º 2) numa lâmina de microscópio;
2) Preparar esfregaços de controlo positivo com uma estirpe de R. solanacearum Biovar 2 e, se necessário, um esfregaço de uma espécie reconhecidamente negativa no teste PHB como controlo negativo;
3) Deixar secar ao ar e, em seguida, passar rapidamente a parte inferior de cada lâmina à chama para fixar os esfregaços;
4) Corar a preparação com azul de Nilo ou negro de Sudão e observar ao microscópio de acordo com o procedimento a seguir descrito:
Teste de azul de Nilo:
a) Cobrir cada lâmina com uma solução aquosa a 1% de azul de Nilo A e incubar durante 10 minutos a uma temperatura de 55ºC;
b) Sacudir as gotas de solução corante. Lavar brevemente e com cuidado em água corrente. Retirar o excesso de água com papel absorvente;
c) Cobrir o esfregaço com uma solução aquosa a 8% de ácido acético e incubar durante um minuto à temperatura ambiente;
d) Lavar brevemente e com cuidado em água corrente. Retirar o excesso de água com papel absorvente;
e) Voltar a humedecer com uma gota de água e cobrir com uma lamela;
f) Examinar o esfregaço corado coberto com uma gota de óleo de imersão em microscópio de epifluorescência a 450 nm, utilizando uma objectiva de imersão em óleo ou água e uma ampliação de 600-1000X;
g) Os grânulos de PHB apresentam uma fluorescência laranja viva. Observar também com luz normal transmitida para verificar se os grânulos são intracelulares e se a morfologia das células é típica de R. solanacearum.
Teste do negro de Sudão:
a) Corar cada lâmina com uma solução a 0,3% de negro de Sudão B em etanol a 70% e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente;
b) Sacudir as gotas de solução corante e lavar brevemente em água corrente, retirando o excesso de água com papel absorvente;
c) Mergulhar as lâminas brevemente em xilol e secar sobre papel absorvente.
Nota. – Cuidado! O xilol é um produto nocivo. Tomar as medidas de segurança necessárias e trabalhar em «hotte».
d) Corar as lâminas com uma solução aquosa a 0,5% (p/v) de safranina e incubar durante 10 segundos à temperatura ambiente;
Nota. – Cuidado! A safranina é um produto nocivo. Tomar as medidas de segurança necessárias e trabalhar em «hotte».
e) Lavar com cuidado em água corrente, secar em papel absorvente e cobrir com uma lamela;
f) Examinar os esfregaços corados cobertos com óleo de imersão em microscópio com luz transmitida e com uma ampliação de 1000X, utilizando uma objectiva de imersão em óleo;
g) Os grânulos de PHB em células de R. solanacearum apresentam uma coloração azul negra e as paredes celulares apresentam uma coloração rosa.
3 – Testes serológicos de aglutinação:
A melhor forma de observar a aglutinação de células de R. solanacearum em exsudado bacteriano ou extractos de tecido sintomático é mediante a utilização de anticorpos marcados validados (ver apêndice n.º 3), utilizando marcadores corados adequados como, por exemplo, células de Staphylococcus aureus ou partículas de látex coradas. Em caso de utilização de material disponível no mercado (ver apêndice n.º 3), seguir as instruções do fabricante. Caso contrário, aplicar o procedimento seguinte:
a) Misturar gotas de uma suspensão de anticorpos marcados e exsudado bacteriano (aproximadamente 5 (mi)l de cada) nos poços de lâminas multiteste;
b) Preparar controlos positivos e negativos utilizando suspensões de R. solanacearum Biovar 2 e de uma estirpe heteróloga,
c) Depois de homogeneizar com cuidado durante 15 segundos, observar a produção de aglutinação nas amostras positivas.
4 – Isolamento selectivo:
4.1 – Diluição em placas com meio selectivo:
Nota. – Antes de utilizar este método pela primeira vez, efectuar testes preliminares para garantir a detecção reprodutível de 10(elevado a 3) a 10(elevado a 4) unidades formadoras de colónias (ufc) de R. solanacearum por ml adicionadas a extractos de amostras que apresentaram anteriormente resultados negativos.
Utilizar um meio selectivo devidamente validado, como o SMSA (alterado por Elphinstone et al., 1996, ver apêndice n.º 2).
É necessário estar atento de forma a diferenciar R. solanacearum de outras bactérias que possam desenvolver colónias no meio. Além disso, as colónias de R. solanacearum podem apresentar morfologia atípica em caso de sobrepopulação das placas ou se estiverem também presentes bactérias antagonistas. Se se suspeitar de efeitos de competição ou antagonismo, a amostra deve ser reanalisada utilizando um teste diferente.
Pode esperar-se a sensibilidade de detecção mais elevada com este método quando se utilizam extractos de amostras recentemente preparados. No entanto, o método pode também ser aplicado a extractos que tenham sido armazenados em glicerol a uma temperatura compreendida entre 68 e 86ºC.
Como controlos positivos, preparar diluições decimais de uma suspensão de 10(elevado a 6) ufc por ml de uma estirpe virulenta de R. solanacearum Biovar 2 (por exemplo, NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857). Para evitar qualquer possibilidade de contaminação, os controlos positivos devem ser sempre preparados à parte das amostras a testar.
A boa qualidade de cada novo lote de meio selectivo para o crescimento do patogéneo deve ser testada antes da sua utilização para a análise de amostras de rotina.
Testar o material de controlo de forma idêntica à da(s) amostra(s).
4.1.1 – Aplicar uma técnica de diluição em placas adequada, a fim de garantir a diluição de eventuais populações saprófitas formadoras de colónias. Espalhar, por placa, 50-100 (mi)l de extracto de amostra por cada diluição.
4.1.2 – Incubar as placas a 28ºC. Observar as placas após 48 horas e em seguida diariamente durante um período de até 6 dias. As colónias típicas de R. solanacearum em SMSA apresentam, de início, uma cor branca leitosa, são achatadas, irregulares e fluida se após 3 dias de incubação o centro adquire uma coloração rosa a vermelho-vivo com estrias ou espirais internas (ver sítio web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).
Nota. – Neste meio formam-se por vezes colónias atípicas de R. solanacearum, que podem ser pequenas, redondas, completamente vermelhas e não fluidas ou apenas parcialmente fluidas e, portanto, difíceis de distinguir de bactérias saprófitas formadoras de colónias.
4.1.3 – Purificar as presumíveis colónias de R. solanacearum por reticulado ou diluição em placas num meio nutritivo geral a fim de obter colónias isoladas (ver apêndice n.º 2).
4.1.4 – Armazenar as culturas a curto prazo em água desionizada esterilizada (pH 6-8) à temperatura ambiente, no escuro, ou a longo prazo num meio crioprotector adequado entre 68 e 86ºC ou liofilizadas.
4.1.5 – Identificar culturas de presumíveis isolados de R. solanacearum (ver parte B da secção VI) e efectuar um teste de patogenicidade (ver parte C da secção VI).
Interpretação dos resultados da diluição em placas com meio selectivo:
O teste de diluição em placas com meio selectivo é negativo se não for observada nenhuma colónia bacteriana ao fim de seis dias ou se não forem encontradas colónias presumivelmente características de R. solanacearum, desde que não se suspeite de inibição resultante de concorrência ou antagonismo de outras bactérias e que sejam detectadas colónias características de R. solanacearum nos controlos positivos.
O teste de diluição em placas com meio selectivo é positivo se forem isoladas colónias de presumíveis isolados de R. solanacearum.
4.2 – Operação de enriquecimento:
Utilizar um meio de enriquecimento validado, como o caldo Wilbrink modificado (ver apêndice n.º 2).
Este procedimento pode ser utilizado para aumentar selectivamente as populações de R. solanacearum nos extractos de amostras e aumentar a sensibilidade de detecção. Este procedimento também dilui de forma eficaz os inibidores da reacção da PCR (1:100). Importa referir, no entanto, que o enriquecimento de R. solanacearum pode ser infrutífero devido à competição ou ao antagonismo de organismos saprófitas, que em muitos casos são enriquecidos simultaneamente. Por esta razão, o isolamento de R. solanacearum a partir de meios líquidos de cultura enriquecidos pode ser difícil. Além disso, como as populações de saprófitas serologicamente afins podem aumentar, recomenda-se a utilização de anticorpos monoclonais específicos em vez de anticorpos policlonais quando se utilize o teste ELISA.
4.2.1 – Para o teste PCR com enriquecimento, transferir 100 (mi)l de extracto de amostra para 10 ml de meio líquido de enriquecimento (apêndice n.º 2) previamente separado em alíquotas para tubos ou frascos isentos de ADN. Para o teste ELISA com enriquecimento podem utilizar-se diluições mais concentradas do extracto da amostra (por exemplo 100 (mi)l em 1,0 ml de caldo de enriquecimento).
4.2.2 – Incubar durante 72 horas a uma temperatura compreendida entre os 27 e 30ºC em cultura agitada ou estática, mantendo as tampas dos recipientes apertadas frouxamente para permitir o arejamento.
4.2.3 – Misturar bem antes de utilizar nos testes ELISA ou PCR.
4.2.4 – Tratar o meio líquido enriquecido de modo idêntico ao da(s) amostra(s) nos testes acima referidos.
Nota. – Se for de prever a inibição do enriquecimento de R. solanacearum devido à existência de grandes populações de certas bactérias saprófitas competidoras, poderão conseguir-se melhores resultados como enriquecimento dos extractos de amostras antes de se efectuar uma centrifugação ou outros processos de concentração.
5 – Teste IF:
Princípio:
A utilização do teste IF como teste de rastreio essencial é recomendada, tendo em conta a sua robustez comprovada para alcançar os limiares de detecção exigidos.
Sempre que se utilize o teste IF como teste de rastreio essencial e o seu resultado seja positivo, terá de se realizar o teste de isolamento, o teste PCR ou o teste FISH como segundo teste de rastreio. Sempre que se utilize o teste IF como segundo teste de rastreio e o seu resultado seja positivo, terão de se realizar mais testes de acordo com o fluxograma para completar a análise.
Nota. – Utilizar anticorpos validados para R. solanacearum (ver sítio web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Recomenda-se a determinação do título para cada novo lote de anticorpos. O título é definido como a diluição mais elevada para a qual se verifica uma reacção óptima ao testar uma suspensão contendo 10(elevado a 5) a 10(elevado a 6) células por ml de uma estirpe homóloga de R. solanacearum e recorrendo a um conjugado de isotiocianato de fluoresceína (FITC), de acordo com as recomendações do fabricante. Todos os anti-soros policlonais validados têm um título de IF de 1:2000 no mínimo. Durante o teste os anticorpos devem ser utilizados em diluições de trabalho próximas do título ou no seu valor exacto.
O teste deve ser realizado com extractos de amostras recentemente preparados. Se necessário, pode ser executado com sucesso com extractos armazenados entre 68 e 86ºC e conservados em glicerol. O glicerol pode ser retirado da amostra através da adição de 1 ml de tampão de ressuspensão (apêndice n.º 4), nova centrifugação durante 15 minutos a 7000 g e ressuspensão num volume igual de tampão de ressusp