Segurança Alimentar Desde 2004 a tratar da Segurança Alimentar em Portugal
Decreto-Lei n.º 248/2007
PÁGINAS DO DR : 4069 a 4095
A doença provocada pelo agente patogénico Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus (Spieckerman et Kottoff) Davis et al., vulgarmente designada por podridão anelar da batata, é um factor de redução da produção da cultura da batateira e representa um risco para esta cultura não só no País como também em todo o território comunitário se não forem tomadas medidas de protecção fitossanitária eficazes.
Tornou-se, pois, necessário estabelecer medidas de controlo fitossanitário destinadas a evitar a introdução e a dispersão daquele organismo patogénico no território nacional, competindo, para o efeito, à Direcção-Geral da Agricultura e Desenvolvimento Rural a definição, a elaboração, a coordenação e a aplicação do programa nacional de prospecção do organismo prejudicial.
Neste contexto, foi publicada a Portaria n.º 140/95, de 9 de Fevereiro, que aprovou as medidas fitossanitárias destinadas a evitar a introdução e a propagação daquele agente patogénico no território nacional e definiu os procedimentos a adoptar para a implementação do referido programa, através nomeadamente de disposições técnicas quanto à forma de conservação das amostras testadas e rastreabilidade do organismo prejudicial, transpondo a Directiva n.º 93/85/CE, do Conselho, de 4 de Outubro, relativa à luta contra a podridão anelar da batateira.
Foi, entretanto, publicada a Directiva n.º 2006/56/CE, da Comissão, de 12 de Junho, que veio alterar os anexos da Directiva n.º 93/85/CE, do Conselho, de 4 de Outubro. Estes anexos foram substancialmente alterados, quer para fazer face aos avanços significativos em termos da compreensão da biologia, dos procedimentos de detecção e de identificação do agente patogénico quer para enquadrar a experiência obtida na luta contra aquele organismo prejudicial através da revisão de várias disposições técnicas relacionadas com as medidas de controlo.
No tocante aos procedimentos de detecção e de identificação, foram introduzidos procedimentos recentemente desenvolvidos como a hibridação fluorescente in situ (FISH) e a reacção em cadeia da polimerase (PCR), bem como melhorias nos diversos métodos laboratoriais a utilizar.
Quanto aos elementos técnicos das medidas de controlo, introduzem-se disposições que permitem melhorar a forma de conservação das amostras testadas, no sentido de assegurar a rastreabilidade do organismo prejudicial, a reunião dos elementos necessários para determinar a dimensão provável da contaminação, os pormenores da comunicação de qualquer presença confirmada do organismo prejudicial e da zona contaminada relevante e a aplicação das medidas em locais de produção designados como contaminados e no interior das zonas demarcadas.
Deste modo, face à obrigatoriedade de proceder à transposição da Directiva n.º 2006/56/CE, da Comissão, de 12 de Junho, aliada ao facto de ser necessário actualizar, por um lado, não só todo o regime específico de medidas fitossanitárias aplicáveis mas também as referências aos serviços oficiais com competências na matéria e, por outro, enquadrar tais disposições com o actual regime fitossanitário aprovado pelo Decreto-Lei n.º 154/2005, de 6 de Setembro, importa que se opte por publicar um decreto-lei que comporte a consolidação legislativa de toda a matéria em apreço.
Foram ouvidos os órgãos de governo próprio das Regiões Autónomas.
Foi promovida a audição do Conselho Nacional do Consumo.
Assim:
Nos termos da alínea a) do n.º 1 do artigo 198.º da Constituição, o Governo decreta o seguinte:
CAPÍTULO I
Disposições gerais
Artigo 1.º
Transposição de directivas
O presente decreto-lei transpõe para a ordem jurídica interna a Directiva n.º 2006/56/CE, da Comissão, de 12 de Junho, que altera os anexos da Directiva n.º 93/85/CE, do Conselho, de 4 de Outubro, relativa à luta contra a podridão anelar da batateira, procedendo, simultaneamente, à consolidação legislativa da transposição de ambas as directivas.
Artigo 2.º
Objecto
1 – O presente decreto-lei estabelece as medidas de controlo fitossanitário a adoptar em relação à bactéria Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus (Spieckerman et Kottoff) Davis et al., causadora da podridão anelar da batateira, a seguir designada por organismo prejudicial, no sentido de evitar o seu aparecimento e, uma vez detectada, localizá-la e determinar a sua distribuição, evitar a sua dispersão e combatê-la com vista à sua eventual erradicação.
2 – O disposto no presente decreto-lei é aplicável, sem prejuízo do disposto no Decreto-Lei n.º 154/2005, de 6 de Setembro, na redacção que lhe foi dada pelo Decreto-Lei n.º 193/2006, de 26 de Setembro, que actualiza o regime fitossanitário que cria e define as medidas de protecção fitossanitária destinadas a evitar a introdução e dispersão no território nacional e comunitário, incluindo nas zonas protegidas, de organismos prejudiciais aos vegetais e produtos vegetais, qualquer que seja a sua origem ou proveniência.
CAPÍTULO II
Controlo do organismo prejudicial
Artigo 3.º
Prospecção oficial
1 – Para efeitos do disposto no n.º 1 do artigo anterior, a Direcção-Geral da Agricultura e Desenvolvimento Rural (DGADR) define, elabora e coordena a aplicação do programa nacional de prospecção do organismo prejudicial, cuja execução se realiza anualmente.
2 – A execução do programa de prospecção referido no número anterior cabe aos serviços de inspecção fitossanitária das direcções regionais de agricultura e pescas (DRAP) e dos correspondentes organismos das Regiões Autónomas dos Açores e da Madeira, nas respectivas áreas de actuação.
3 – As prospecções previstas no programa nacional incidem obrigatoriamente sobre tubérculos e, sempre que apropriado, em plantas de batateira de Solanum tuberosum L., sendo que:
a) Quando se tratar de tubérculos, são colhidas amostras tanto de batata-semente como de outras batatas, de preferência provenientes de lotes em armazém, que são submetidas a testes laboratoriais oficiais ou realizados sob controlo oficial, utilizando o método para a detecção e diagnóstico do organismo prejudicial referido no número seguinte, podendo, se adequado, ser efectuada uma inspecção visual oficial ou oficialmente controlada, através de corte de tubérculos noutras amostras;
b) Quando se tratar de plantas, estas prospecções são efectuadas segundo métodos adequados e as amostras são submetidas a testes laboratoriais de acordo com o disposto no número seguinte.
4 – O método de diagnóstico, detecção e identificação do organismo prejudicial nos tubérculos é o referido no anexo I do presente decreto-lei, do qual faz parte integrante, devendo ser utilizado para as plantas de batateira qualquer outro método adequado oficial ou oficialmente controlado.
5 – A DGADR deve comunicar anualmente à Comissão Europeia e aos demais Estados membros os resultados da execução do programa nacional de prospecção do organismo prejudicial.
Artigo 4.º
Dever de informação em relação ao organismo prejudicial
Qualquer pessoa que saiba ou suspeite da presença do organismo prejudicial em plantas de batateira e ou em tubérculos colhidos, armazenados ou comercializados no território nacional deve informar de imediato os serviços de inspecção fitossanitária das DRAP ou a DGADR.
Artigo 5.º
Procedimentos no caso de suspeita da presença do organismo prejudicial
1 – Considera-se estar perante uma ocorrência suspeita quando a confirmação da presença do organismo prejudicial se tenha verificado por meio de:
a) Observação de sintomas visuais de diagnóstico suspeito da doença; ou
b) Obtenção de um resultado positivo num teste de imunofluorescência, através de uma leitura positiva num teste de rastreio confirmada por um resultado positivo num segundo teste de rastreio apropriado (PCR/FISH), tal como consta do anexo I.
2 – Em caso de ocorrência suspeita, os serviços de inspecção fitossanitária da DRAP competente devem:
a) Assegurar a realização de testes laboratoriais oficiais ou oficialmente controlados, conforme previsto no n.º 4 do artigo 3.º, de acordo com as condições definidas no n.º 1 do anexo II do presente decreto-lei, do qual faz parte integrante, a fim de confirmar ou refutar a ocorrência suspeita;
b) Proibir a utilização e a circulação de todos os lotes ou remessas dos quais tenham sido colhidas amostras, excepto sob o seu controlo e desde que se tenha concluído que não existe qualquer risco identificável de dispersão do organismo prejudicial;
c) Adoptar medidas adicionais a fim de determinar a origem da ocorrência suspeita e evitar a dispersão do organismo prejudicial.
Artigo 6.º
Procedimentos no caso de confirmação da presença do organismo prejudicial
1 – Sempre que a presença do organismo prejudicial seja confirmada através dos testes laboratoriais referidos no n.º 4 do artigo 3.º, os serviços de inspecção fitossanitária da DRAP competente devem:
a) Zelar pelo cumprimento dos procedimentos estabelecidos no n.º 2 do anexo II;
b) Declarar contaminados os tubérculos e ou plantas de batateira, as remessas e ou lotes, a maquinaria, os veículos, os navios, os armazéns ou respectivas partes e quaisquer outros objectos, incluindo material de embalagem, em que tiver sido colhida a amostra, e, quando adequado, o local ou locais de produção e os campos onde tiverem sido colhidos os tubérculos ou as plantas de batateira;
c) Determinar, na sequência da declaração de contaminação dos tubérculos ou plantas de batateira, a realização de testes laboratoriais de acordo com o disposto no n.º 4 do artigo 3.º nos lotes de batata com uma relação clonal com a batata infectada, sendo que os testes são realizados no número de tubérculos ou plantas necessário para determinar a provável fonte primária de infecção e a extensão da contaminação provável, de preferência por ordem do grau de risco;
d) Determinar, tendo em conta o disposto no n.º 1 do anexo III do presente decreto-lei, do qual faz parte integrante, a extensão da contaminação provável por contacto pré ou pós-colheita ou por relação de produção com a contaminação declarada;
e) Demarcar uma zona, com base na declaração de contaminação, na determinação da extensão da contaminação provável e na possível dispersão do organismo prejudicial, tendo em conta o disposto no n.º 2 do anexo III.
2 – A DGADR deve comunicar à Comissão Europeia e aos outros Estados membros qualquer contaminação declarada e os pormenores respeitantes à demarcação da zona.
3 – A comunicação referida no número anterior deve ser efectuada nos termos do disposto no n.º 3 do anexo III.
Artigo 7.º
Medidas de protecção fitossanitária subsequentes
1 – Os tubérculos e ou as plantas de batateira declarados contaminados não podem ser plantados e, sob controlo dos serviços de inspecção fitossanitária da DRAP competente são:
a) Destruídos;
b) Eliminados de outro modo, de acordo com medidas oficialmente controladas, nos termos do n.º 1 do anexo IV e do anexo V do presente decreto-lei, do qual fazem parte integrante, desde que se tenha concluído não existir qualquer risco identificável de dispersão do organismo prejudicial.
2 – Os tubérculos e ou as plantas de batateira considerados provavelmente contaminados não podem ser plantados e, sem prejuízo do resultados dos testes referidos na alínea c) do n.º 1 do artigo anterior, para os lotes de batata com relação clonal, são, sob controlo dos serviços de inspecção fitossanitária da DRAP competente, alvo de utilização ou eliminação adequados, nos termos especificados no n.º 2 do anexo IV, e em condições que garantam a inexistência de qualquer risco identificável de dispersão do organismo prejudicial.
3 – Toda a maquinaria, os veículos, os navios, os armazéns ou respectivas partes e quaisquer outros objectos, incluindo o material de embalagem, declarados contaminados ou considerados provavelmente contaminados são destruídos ou limpos e desinfectados segundo métodos adequados, como especificado no n.º 3 do anexo IV, sendo que após a desinfecção esses objectos deixam de ser considerados contaminados.
4 – Sem prejuízo das medidas aplicadas nos termos dos números anteriores, na zona demarcada são, também, aplicadas as medidas especificadas no n.º 4 do anexo IV.
5 – Só é permitida a plantação de batata-semente desde que:
a) Sejam satisfeitas as exigências estabelecidas no Decreto-Lei n.º 154/2005, de 6 de Setembro;
b) A batata seja proveniente, em linha directa, de material obtido no âmbito de um programa oficialmente aprovado que tenha sido declarado isento do organismo prejudicial em testes oficiais ou controlados oficialmente, utilizando o método previsto no n.º 4 do artigo 3.º
6 – Os testes referidos na alínea b) do número anterior devem ser realizados:
a) Quando a contaminação afectar a produção de batata-semente nas plantas da selecção clonal inicial;
b) Nos restantes casos, tanto nas plantas da selecção clonal inicial como em amostras representativas de batata-semente de base ou de material de multiplicação anterior.
Artigo 8.º
Notificação das medidas fitossanitárias
As medidas de protecção fitossanitária determinadas e mandadas aplicar são objecto de notificações oficiais emanadas das DRAP, dirigidas às pessoas singulares e colectivas envolvidas.
Artigo 9.º
Encargos dos operadores económicos
Os encargos resultantes da aplicação das medidas de protecção fitossanitária referidas no número anterior são suportados pelos respectivos operadores económicos.
Artigo 10.º
Proibição
É proibida a posse e manuseamento do organismo prejudicial.
Artigo 11.º
Derrogações
Para fins experimentais ou científicos e trabalhos de selecção varietal, a DGADR pode autorizar a não execução do disposto na alínea c) do n.º 1 do artigo 6.º, nos n.os 1 a 4 do artigo 7.º e no artigo 10.º, para efeitos de aplicação do Decreto-Lei n.º 91/98, de 14 de Abril, que estabelece as condições pelas quais determinados organismos prejudiciais, vegetais, produtos vegetais e outros materiais podem ser introduzidos ou circular na Comunidade ou em zonas protegidas para fins experimentais ou científicos e trabalhos de selecção de variedades.
CAPÍTULO III
Regime contra-ordenacional
Artigo 12.º
Contra-ordenações
1 – As seguintes infracções constituem contra-ordenações puníveis com coima cujo montante mínimo é de (euro) 100 e máximo de (euro) 3740 ou mínimo de (euro) 250 e máximo de (euro) 44890, consoante o agente seja pessoa singular ou colectiva:
a) A omissão do dever de informação previsto no artigo 4.º;
b) O não cumprimento das medidas de protecção fitossanitária determinadas e mandadas aplicar ao abrigo do artigo 8.º e em violação do disposto nos artigos 5.º e 7.º;
c) O não cumprimento dos encargos financeiros resultantes da aplicação das medidas de protecção fitossanitária a aplicar ao abrigo do artigo 8.º, em violação do disposto no artigo 9.º;
d) A posse e o manuseamento do organismo prejudicial, em violação do disposto no artigo 10.º
2 – A tentativa e a negligência são puníveis, sendo nesse caso reduzidos para metade os limites mínimos e máximos referidos no número anterior.
Artigo 13.º
Sanções acessórias
1 – Em função da gravidade da infracção e da culpa do agente, podem ser aplicadas, simultaneamente com as coimas, as seguintes sanções acessórias:
a) Perda de objectos pertencentes ao agente;
b) Interdição do exercício de profissões ou actividades cujo exercício dependa de título público ou de autorização ou de homologação de autoridade pública;
c) Privação do direito a subsídio ou benefício outorgado por entidades ou serviços públicos;
d) Privação do direito de participar em feiras ou mercados;
e) Encerramento de estabelecimento cujo funcionamento esteja sujeito a autorização de autoridade administrativa;
f) Suspensão de autorizações.
2 – As sanções previstas no número anterior têm a duração máxima de um ano.
3 – No caso de uma conduta contra-ordenacional ter ocasionado um grave risco de propagação do organismo prejudicial, deve ser dada publicidade à decisão condenatória definitiva de aplicação da coima, mediante a afixação de editais na sede da DRA da área onde foi praticada a infracção.
Artigo 14.º
Processos de contra-ordenação
Sem prejuízo das competências atribuídas por lei às autoridades policiais e fiscalizadoras, o levantamento dos autos e a instrução dos processos de contra-ordenação são da competência da DRAP da região em cuja área foi praticada a contra-ordenação, competindo ao director-geral da Agricultura e Desenvolvimento Rural a aplicação das coimas e sanções acessórias.
Artigo 15.º
Produto das coimas
O produto das coimas reverte:
a) Em 10% para a entidade que levantou o auto de contra-ordenação;
b) Em 10% para a entidade que instruiu o processo;
c) Em 20% para a entidade que aplicou a coima;
d) Em 60% para o Estado.
CAPÍTULO IV
Disposições finais
Artigo 16.º
Aplicação às Regiões Autónomas
1 – Sem prejuízo das competências atribuídas à DGADR na qualidade de autoridade fitossanitária nacional, as competências atribuídas pelo presente decreto-lei às DRAP são exercidas nas Regiões Autónomas dos Açores e da Madeira pelos organismos dos departamentos regionais competentes.
2 – As competências previstas no artigo 14.º são exercidas nas Regiões Autónomas dos Açores e da Madeira pelos organismos definidos pelos órgãos de governo próprio.
3 – As percentagens previstas no artigo 15.º provenientes das coimas aplicadas nas Regiões Autónomas dos Açores e da Madeira constituem receita própria de cada uma delas.
Artigo 17.º
Norma revogatória
É revogada a Portaria n.º 140/95, de 9 de Fevereiro.
Artigo 18.º
Remissão
Todas as referências feitas para a portaria que agora se revoga consideram-se feitas para o presente decreto-lei.
Visto e aprovado em Conselho de Ministros de 3 de Maio de 2007. – José Sócrates Carvalho Pinto de Sousa – Luís Filipe Marques Amado – Fernando Teixeira dos Santos – Alberto Bernardes Costa – Francisco Carlos da Graça Nunes Correia – Manuel António Gomes de Almeida de Pinho – Jaime de Jesus Lopes Silva.
Promulgado em 11 de Junho de 2007.
Publique-se.
O Presidente da República, ANÍBAL CAVACO SILVA.
Referendado em 14 de Junho de 2007.
O Primeiro-Ministro, José Sócrates Carvalho Pinto de Sousa.
ANEXO I
Esquema de ensaio para diagnóstico, detecção e identificação da bactéria responsável pela podridão anelar da batateira, Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus (Spieckermann e Kotthoff) Davis et al., para efeitos do presente anexo designada por C. m. subsp. sepedonicus.
Âmbito do esquema de ensaio
O esquema de ensaio apresentado descreve os vários procedimentos envolvidos:
i) No diagnóstico da podridão anelar em tubérculos e plantas de batateira;
ii) Na detecção de C. m. subsp. sepedonicus em amostras de tubérculos e plantas de batateira;
iii) Na identificação de C. m. subsp. sepedonicus.
Princípios gerais:
Nos apêndices são apresentados os protocolos optimizados para os diversos métodos, reagentes validados e pormenores relativos à preparação dos materiais para realização dos testes e para os controlos. O apêndice n.º 1 apresenta uma lista dos laboratórios que foram incluídos na optimização e validação dos protocolos.
Visto que os protocolos envolvem a detecção de um organismo de quarentena e incluem a utilização de culturas viáveis de C. m. subsp. sepedonicus como materiais de controlo, é necessário executar os procedimentos sob condições de quarentena adequadas, em instalações com sistemas apropriados de eliminação de resíduos e possuindo as licenças adequadas emitidas pelas autoridades oficiais competentes em matéria de quarentena fitossanitária.
Os parâmetros dos ensaios devem assegurar níveis de detecção de C. m. subsp. sepedonicus consistentes e reprodutíveis nos limiares definidos para os métodos seleccionados.
É primordial a preparação rigorosa dos controlos positivos.
A realização dos ensaios de acordo com os limiares exigidos implica também uma correcta regulação, manutenção e calibração do equipamento, manuseamento e preservação cuidadosos dos reagentes e estabelecimento de todas as medidas destinadas a evitar a contaminação entre amostras, por exemplo, a separação dos controlos positivos das amostras a testar. Devem ser aplicadas normas de controlo de qualidade no sentido de evitar erros administrativos e outros, em especial relativamente à rotulagem e documentação.
Uma ocorrência suspeita, tal como referido no n.º 1 do artigo 5.º, implica um resultado positivo nos testes de diagnóstico ou de rastreio numa amostra, tal como especificado nos fluxogramas.
Caso o primeiro teste de rastreio (IF ou PCR/FISH) seja positivo, suspeita-se, então, de contaminação por C. m. subsp. sepedonicus e deve efectuar-se um segundo teste de rastreio. Se o segundo teste de rastreio for positivo, confirma-se, então, a suspeita (ocorrência suspeita) e devem continuar-se os testes de acordo com o esquema. Caso o segundo teste de rastreio seja negativo, a amostra é, então, considerada não contaminada por C. m. subsp. sepedonicus.
Por isso, tal como referido na alínea b) do n.º 1 do artigo 5.º, um teste IF positivo é definido por uma leitura IF positiva confirmada por um segundo teste de rastreio (PCR/FISH).
A presença confirmada, tal como referido no n.º 1 do artigo 6.º, implica o isolamento e identificação de uma cultura pura de C. m. subsp. sepedonicus com confirmação de patogenicidade.
1. – Apresentação do Fluxograma:
1.1. – Esquema para o diagnóstico de podridão anelar em tubérculos e plantas de batateira que apresentem sintomas de podridão anelar:
O procedimento laboratorial destina-se à análise de tubérculos e plantas de batateira que apresentem sintomas típicos ou suspeitos de podridão anelar. Compreende um teste rápido de rastreio, isolamento do patogéneo a partir de tecido vascular infectado em meios de cultura adequados e, em caso de resultado positivo, identificação da cultura como C. m. subsp. sepedonicus.
1.2. – Esquema para detecção e identificação de C.m. subsp. sepedonicus em amostras de tubérculos de batateira assintomáticos:
Princípio:
O procedimento laboratorial destina-se à detecção de infecções latentes em tubérculos de batateira. Um resultado positivo em, pelo menos, dois testes de rastreio baseados em princípios biológicos distintos tem de ser complementado pelo isolamento do patogéneo, seguido de, em caso de isolamento de colónias típicas, confirmação da identificação da cultura pura como sendo de C. m. subsp. sepedonicus. Um resultado positivo em apenas um dos testes de rastreio não é suficiente para considerar a amostra como suspeita.
Os testes de rastreio e de isolamento devem permitir um limiar de detecção de 10(elevado a 3) a 10(elevado a 4) células por ml de sedimento ressuspenso, incluídas como controlos positivos em cada série de testes.
(ver documento original)
1.3 Esquema para detecção e identificação de C. m. subsp. sepedonicus em amostras de plantas de batateira assintomáticas:
(ver documento original)
2 – Observação visual dos sintomas de podridão anelar:
2.1 – Plantas de batateira:
Tendo em conta as condições climáticas europeias, os sintomas raramente se observam no campo e, frequentemente, apenas no final do ciclo vegetativo. Além disso, os sintomas são frequentemente mascarados ou confundidos com os provocados por outras doenças, ou causados por senescência ou ainda por danos mecânicos. Por este motivo, pode não ser fácil detectar os sintomas no decurso das inspecções de campo. Os sintomas de murchidão são muito diferentes dos causados pelo pus ou mal murcho; a murchidão é normalmente lenta e limita-se inicialmente às margens da folha. As folhas novas infectadas continuam frequentemente a expandir-se, apesar de esta expansão ser menor nas zonas infectadas. Este fenómeno dá origem a folhas com formatos fora do normal. As folhas afectadas pela obstrução dos tecidos vasculares localizados em zonas inferiores do caule desenvolvem com frequência, entre as nervuras, áreas cloróticas, amarelas a alaranjadas. Os folíolos, as folhas desenvolvidas e até os caules infectados podem, eventualmente, morrer. Frequentemente, as folhas e os tubérculos podem apenas apresentar um tamanho reduzido. Ocasionalmente, as plantas apresentam nanismo. Podem encontrar-se imagens a cores de um conjunto de sintomas no sítio web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.
2.2 – Tubérculos de batateira:
Os primeiros sintomas observam-se nos tecidos que envolvem o anel vascular, particularmente nas imediações da zona do hilo, que se apresentam ligeiramente vidrados ou translúcidos, sem podridões. O anel vascular à volta do hilo pode ter uma cor ligeiramente mais escura do que o normal. O primeiro sintoma facilmente identificável é a coloração amarelada do anel vascular e, quando se pressiona suavemente o tubérculo, emerge dos vasos um exsudado sob a forma de fitas. Esta exsudação contém milhões de bactérias. O tecido vascular pode tornar-se acastanhado e os sintomas no tubérculo, nesta fase, são semelhantes aos do pus ou mal murcho provocado por Ralstonia solanacearum. No início, estes sintomas podem limitar-se a uma parte do anel, não necessariamente perto do hilo, e, em seguida, podem progredir gradualmente, atingindo todo o anel. À medida que a infecção progride, dá-se a destruição do tecido vascular e o córtex externo pode separar-se do córtex interno. Nos estádios mais avançados da infecção, surgem fissuras na superfície do tubérculo, frequentemente castanhas/avermelhadas nas margens. Registaram-se recentemente na Europa vários casos em que o córtex central apodrece ao mesmo tempo que o anel vascular, o que resulta numa invasão secundária com perfurações internas e necroses. Os sintomas podem ser camuflados por invasões por fungos ou bactérias secundárias, e pode ser difícil, ou mesmo impossível, distinguir os sintomas da podridão anelar numa fase avançada de qualquer outra podridão dos tubérculos. Existe a possibilidade de se verificarem sintomas atípicos. Podem encontrar-se imagens a cores de um conjunto de sintomas no sítio web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.
3 – Preparação da amostra:
3.1 – Tubérculos de batateira:
Nota. – A dimensão normal da amostra é de 200 tubérculos por teste. Uma amostragem mais intensiva exige a realização de mais testes em amostras desta dimensão. Uma amostra com um maior número de tubérculos conduzirá à incapacidade ou a uma maior dificuldade em termos de interpretação dos resultados. Contudo, este procedimento pode ser aplicado a amostras com menos de 200 tubérculos, sempre que este número de tubérculos não se encontre disponível.
A validação de todos os métodos de detecção abaixo descritos tem por base a análise de amostras constituídas por 200 tubérculos.
O extracto de batata descrito em seguida pode também ser utilizado para a detecção da bactéria Ralstonia solanacearum, bactéria responsável pela doença do pus ou mal murcho da batateira.
Pré-tratamento opcional antes da preparação da amostra:
Lavar os tubérculos. Utilizar os desinfectantes (compostos de cloro sempre que se utilizar o teste PCR, para destruir ADN de organismos saprófitas) e detergentes adequados entre cada amostra. Secar os tubérculos ao ar. Este procedimento de lavagem é útil (mas não obrigatório), em especial para amostras que apresentam um excesso de terra e quando se pretender utilizar um teste PCR ou um isolamento directo.
3.1.1 – Remover a epiderme na zona do hilo de cada tubérculo com um bisturi ou faca de cortar legumes, limpos e desinfectados, para que o tecido vascular fique visível. Retirar cuidadosamente um pequeno cone de tecido vascular na zona do hilo, reduzindo ao mínimo a quantidade de tecido não vascular (ver sítio web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main.
Nota. – Pôr de lado qualquer tubérculo que exiba sintomas suspeitos de podridão anelar e testá-los separadamente.
Caso se observem sintomas suspeitos de podridão anelar durante a remoção do cone da zona do hilo, o tubérculo em questão deve ser visualmente inspeccionado após o corte próximo do hilo. Qualquer tubérculo cortado exibindo sintomas suspeitos deverá ser suberizado durante 2 dias à temperatura ambiente e armazenado em quarentena (entre 4° a 10°C) até todos os testes terem sido concluídos. Todos os tubérculos da amostra (incluindo os que apresentam sintomas suspeitos) devem ser conservados de acordo como disposto no anexo II.
3.1.2 – Colocar os cones dos hilos em recipientes descartáveis não utilizados que possam ser fechados e ou selados (caso os recipientes sejam reutilizados devem ser cuidadosamente limpos e desinfectados com compostos de cloro). Os cones dos hilos devem ser, de preferência, processados de imediato. Se tal não for possível, devem ser mantidos no recipiente, sem adição de tampão, em local refrigerado durante, no máximo, 72 horas ou 24 horas à temperatura ambiente. A secagem e a suberização dos cones, bem como o desenvolvimento de saprófitas durante o armazenamento, podem impedir a detecção da bactéria causadora da doença da podridão anelar.
3.1.3 – Processar os cones dos hilos de acordo comum dos seguintes procedimentos:
a) Cobrir os cones com um volume suficiente (cerca de 40 ml) de tampão de extracção (apêndice n.º 3) e colocá-los num agitador rotativo (50-100 rpm) durante 4 horas a uma temperatura inferior a 24ºC ou durante 16-24 horas refrigerados; ou
b) Homogeneizar os cones com um volume suficiente (cerca de 40 ml) de tampão de extracção (apêndice n.º 3) num misturador (por exemplo, Waring Blender ou Ultra Thurrax) ou por esmagamento num saco de maceração descartável selado (por exemplo, Stomacher ou Bioreba em polietileno resistente, de 150 mm x 250 mm, esterilizado por radiação) utilizando um macete de borracha ou um instrumento de trituração adequado (por exemplo, Homex).
Nota. – O risco de contaminação cruzada das amostras é elevado quando estas são homogeneizadas com recurso a um misturador. Tomar as precauções necessárias para evitar a formação de aerossóis ou derrames durante o processo de extracção. Assegurar-se de que as lâminas e os recipientes do misturador utilizados para cada amostra foram recentemente esterilizados. Caso se utilize o teste PCR, evitar a contaminação por ADN dos recipientes ou instrumento de trituração. Sempre que se utilize o teste PCR, recomenda-se a trituração em sacos descartáveis e a utilização de tubos descartáveis.
3.1.4 – Decantar o sobrenadante. Caso se encontre excessivamente turvo, clarificar através de centrifugação a baixa velocidade (a não mais de 180 g durante 10 minutos a uma temperatura entre 4 e 10°C) ou de filtração por vácuo (40-100 (mi)m), lavando o filtro com tampão de extracção adicional (10 ml) (apêndice n.º 3).
3.1.5 – Concentrar a fracção bacteriana por centrifugação a 7000 g durante 15 minutos (ou 10000 g durante 10 minutos) a uma temperatura compreendida entre 4 e 10°C e desprezar o sobrenadante sem perturbar o sedimento.
3.1.6 – Ressuspender o sedimento em 1,5 ml de tampão de ressuspensão (apêndice n.º 3). Utilizar 500(mi)l para o teste de detecção de C. m. subsp. sepedonicus, 500(mi)l para o teste de detecção de Ralstonia solanacearum e 500(mi)l para fins de referência. Adicionar glicerol esterilizado até obter uma concentração final de 10-25% (v/v) aos 500(mi)l das alíquotas de referência e à alíquota remanescente da amostra em estudo; agitar em vórtice e armazenar entre -16 e 24°C (semanas) ou entre 68 e 86°C (meses). Manter a alíquota remanescente da amostra em estudo a uma temperatura entre 4 e 10°C durante o período de ensaio.
Não se aconselha a congelação e descongelação repetidas.
Caso seja necessário transportar o extracto, garantira entrega numa caixa refrigerada num prazo de 24 a 48 horas.
3.1.7 – É indispensável que as amostras e os controlos positivos de C. m. subsp. sepedonicus sejam tratados separadamente para evitar contaminações. O mesmo se aplica às lâminas de imunofluorescência e a todos os testes.
3.2 – Plantas de batateira:
Nota. – Para a detecção de populações latentes de C. m. subsp. sepedonicus, é aconselhável a análise de amostras compostas. O procedimento pode ser aplicado convenientemente a amostras compostas contendo até 200 partes de caule (sempre que forem realizadas prospecções, estas devem basear-se numa amostra estatisticamente representativa da população de plantas em estudo.)
3.2.1 – Com uma faca ou uma tesoura de poda limpas e desinfectadas, remover um segmente de 1-2 cm da base de cada caule, imediatamente acima do nível do solo.
Desinfectar rapidamente os segmentos de caule com etanol a 70% e secá-los imediatamente com papel de filtro.
Recolher os segmentos de caule num recipiente esterilizado fechado, de acordo com os seguintes procedimentos de amostragem:
3.2.2 – Processar os segmentos de caule de acordo com um dos seguintes procedimentos:
a) Cobrir os segmentos com um volume suficiente (cerca de 40ml) de tampão de extracção (apêndice n.º 3) e colocá-los num agitador rotativo (50-100rpm) durante 4 horas a menos de 24°C ou durante 16-24 horas em local refrigerado; ou
b) Processar imediatamente, esmagando os segmentos num saco de maceração resistente (por exemplo, Stomacher ou Bioreba) com um volume adequado de tampão de extracção (apêndice n.º 3), com recurso a um macete de borracha ou um instrumento de trituração adequado (por exemplo, Homex). Se tal não for possível, armazenar os segmentos de caule refrigerados durante, no máximo, 72 horas ou 24 horas à temperatura ambiente.
3.2.3 – Decantar o sobrenadante após 15 minutos de repouso.
3.2.4 – Não é normalmente necessário proceder à clarificação do extracto ou à concentração da fracção bacteriana, mas estes objectivos podem alcançar-se através de filtração e ou centrifugação, tal como descrito nos n.os 3.1.4 a 3.1.6.
3.2.5 – Dividir o extracto puro ou concentrado da amostra em duas partes iguais. Manter uma metade a uma temperatura de 4 a 10°C durante a realização dos testes e armazenar a outra metade com 10-25% (v/v) de glicerol esterilizado a uma temperatura compreendida entre 16 e 24°C (semanas) ou 68 e 86°C(meses), caso seja necessário proceder a mais testes.
4 – Teste IF:
Princípio:
A utilização do teste IF como teste de rastreio principal é recomendada, tendo em conta a sua robustez comprovada para alcançar os limiares de detecção exigidos.
Sempre que se utilize o teste IF como teste de rastreio principal e o seu resultado seja positivo, tem de se realizar o teste PCR ou o teste FISH como segundo teste de rastreio. Sempre que se utilize o teste IF como segundo teste de rastreio e o seu resultado seja positivo, tem de se realizar mais testes de acordo como fluxograma para completar a análise.
Nota. – Utilizar sempre um anticorpo policlonal quando o teste IF for usado como principal teste de rastreio. No caso de se obter um resultado positivo no teste IF com um anticorpo policlonal, as amostras podem ser submetidas a novos testes com um anticorpo monoclonal que, embora apresente uma maior especificidade, pode ser menos sensível.
Utilizar anticorpos contra uma estirpe de referência de C. m. subsp. sepedonicus. Recomenda-se a determinação do título para cada novo lote de anticorpos. O título é definido como a diluição mais elevada para a qual se verifica uma reacção óptima ao testar uma suspensão contendo 10(elevado a 5) a 10(elevado a 6) células por ml da estirpe homóloga de C. m. subsp. sepedonicus, e recorrendo a um conjugado de isotiocianato de fluoresceína (FITC), de acordo com as recomendações do fabricante. Os anticorpos policlonais ou monoclonais nativos devem possuir um título IF de, pelo menos, 1:2000. Durante o teste, os anticorpos devem ser utilizados em diluições de trabalho (DT) próximas do título ou no seu valor exacto. Utilizar anticorpos validados (ver sítio web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).
O teste deve ser realizado com extractos de amostras recentemente preparados. Se necessário, pode ser executado com sucesso em extractos armazenados entre -68 e -86°C e conservados em glicerol. O glicerol pode ser retirado da amostra através da adição de 1 ml de tampão de ressuspensão (apêndice n.º 4), nova centrifugação durante 15 minutos a 7000 g e ressuspensão num volume igual de tampão de ressuspensão. Este procedimento é frequentemente desnecessário, em especial se as lâminas forem fixadas à chama (ver n.º 2.2).
Preparar lâminas de controlo positivo em separado com uma estirpe homóloga, ou qualquer outra estirpe de referência de C. m. subsp. sepedonicus suspensa em extracto de batata, tal como especificado no apêndice n.º 2 e, opcionalmente, em tampão.
Sempre que possível, deve também ser utilizado material vegetal naturalmente infectado (liofilizado ou congelado a uma temperatura compreendida entre 16 e 24°C) como controlo positivo na mesma lâmina.
Como controlos negativos, utilizar alíquotas de extracto de amostra que anteriormente se tenham revelado negativas relativamente à presença de C. m. subsp. sepedonicus.
Utilizar lâminas de microscópio com vários poços, de preferência 10, com, pelo menos, 6 mm de diâmetro cada.
Testar o material de controlo de forma idêntica à da(s) amostra(s).
4.1 – Preparar as lâminas através de um dos seguintes procedimentos:
i) Para sedimentos com relativamente pouco amido:
Pipetar um volume-padrão (15(mi)l é adequado para poços com 6 mm de diâmetro – aumentar o volume proporcionalmente à dimensão dos poços) de uma diluição de 1/100 do sedimento de batata ressuspenso no primeiro poço. Em seguida, pipetar um volume semelhante de sedimento não diluído (1/1) nos restantes poços da fila. A segunda fila de poços pode ser utilizada como um duplicado ou para outra amostra, como indicado na figura n.º 1.
ii) Para outros sedimentos:
Preparar diluições decimais (1/10 e 1/100) do sedimento ressuspenso em tampão de ressuspensão. Pipetar um volume-padrão (15(mi)l é adequado para poços com 6 mm de diâmetro – aumentar o volume proporcionalmente à dimensão dos poços) do sedimento ressuspenso e de cada uma das diluições numa fila de poços. A segunda fila de poços pode ser utilizada como um duplicado ou para outra amostra, como indicado na figura n.º 2.
4.2 – Secar as gotículas à temperatura ambiente ou por aquecimento a uma temperatura compreendida entre 40 e 45°C. Fixar as células bacterianas na lâmina através de aquecimento (15 minutos a 60°C), à chama, com etanol a 95%, ou em conformidade com instruções específicas dos fornecedores dos anticorpos.
Se necessário, as lâminas assim tratadas podem ser armazenadas congeladas numa caixa de dessecação durante o menor tempo possível (até um máximo de 3 meses) antes de serem testadas.
4.3 – Procedimento IF:
i) De acordo com a preparação da lâmina descrita na alínea i) do n.º 4.1:
Preparar um conjunto de diluições a 1/2 do anticorpo em tampão IF. O primeiro poço deve ter 1/2 do título (T/2), os restantes 1/4 do título (T/4), 1/2 do título (T/2), o título (T) e o dobro do título (2T).
ii) De acordo com a preparação da lâmina descrita na alínea ii) do n.º 4.1:
Preparar a diluição de trabalho (DT) do anticorpo em tampão IF. A diluição de trabalho afecta a especificidade.
FIGURA N.º 1
Preparação da lâmina de acordo com a alínea i) do n.º 4.1 e a alínea i) do n.º 4.3
(ver documento original)
FIGURA N.º 2
Preparação da lâmina de acordo com a alínea ii) do n.º 4.1 e a alínea ii) do n.º 4.3
(ver documento original)
4.3.1 – Dispor as lâminas sobre papel de filtro humedecido. Cobrir por completo cada poço contendo a amostra a testar com a(s) diluição(ões) de anticorpo. O volume de anticorpo adicionado a cada poço deve ser, pelo menos, igual ao volume de extracto aplicado.
O procedimento seguinte deve ser efectuado na ausência de instruções específicas dos fornecedores dos anticorpos.
4.3.2 – Incubar as lâminas sobre papel de filtro humedecido durante 30 minutos à temperatura ambiente (18 a 25°C) numa caixa fechada.
4.3.3 – Sacudir as gotículas da lâmina. Lavar por submersão durante 5 minutos em tampão IF-Tween e subsequentemente durante 5 minutos em tampão IF (apêndice n.º 3). Evitar a transferência de aerossóis ou de gotículas, o que poderia dar origem a uma contaminação cruzada. Eliminar cuidadosamente a humidade em excesso, secando suavemente com papel absorvente.
4.3.4 – Dispor as lâminas sobre papel de filtro humedecido. Cobrir os poços contendo as amostras a testar com a diluição do conjugado FITC utilizada para determinar o título. O volume de conjugado FITC adicionado aos poços deve ser idêntico ao volume de anticorpo utilizado.
4.3.5 – Incubar as lâminas sobre papel de filtro humedecido durante 30 minutos à temperatura ambiente (18 a 25°C) numa caixa opaca fechada.
4.3.6 – Sacudir da lâmina as gotículas de conjugado FITC. Lavar como anteriormente (n.º 4.3.3).
Retirar cuidadosamente o excesso de humidade.
4.3.7 – Pipetar para cada poço 5-10(mi)l de uma solução de tampão fosfato 0,1M com glicerol (apêndice n.º 3) ou de um líquido de montagem disponível no mercado que evite a perda rápida de fluorescência e cobrir com uma lamela.
4.4 – Leitura do teste IF:
4.4.1 – Examinar as lâminas do teste num microscópio de epifluorescência, com filtros adequados para excitação do FITC, utilizando uma lente de imersão em óleo ou água, com uma ampliação de 500-1000x. Examinar os poços ao longo de dois diâmetros perpendiculares e à volta do perímetro. Para amostras que não revelem células, ou cujo número seja reduzido, observar, pelo menos, 40 campos do microscópio.
Observar primeiro a lâmina do controlo positivo. As células devem apresentar-se com uma fluorescência brilhante e completamente coradas no título do anticorpo ou diluição de trabalho determinados. O teste IF (n.º 4) deve ser repetido se a coloração for aberrante.
4.4.2 – Observar células fluorescentes brilhantes com a morfologia característica de C. m. subsp. sepedonicus nos poços das lâminas em estudo (ver sítio web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). A intensidade de fluorescência deve ser equivalente à da estirpe do controlo positivo, ou melhor do que esta, para a mesma diluição do anticorpo. As células com coloração incompleta ou com fluorescência fraca não devem ser consideradas.
Caso se suspeite de qualquer contaminação, o teste deve ser repetido. Este pode ser o caso quando todas as lâminas de um lote, revelem células positivas devido à contaminação do tampão ou se forem encontradas células positivas (fora do poço da lâmina) no revestimento da lâmina.
4.4.3 – Há vários problemas inerentes à especificidade do teste de imunofluorescência. Em sedimentos de cones de hilo e de segmentos de caule da batateira, é possível a ocorrência de populações de células fluorescentes com morfologia atípica e reacções cruzadas de bactérias saprófitas com dimensões e morfologia semelhantes a C. m. subsp. sepedonicus.
4.4.4 – Considerar apenas células fluorescentes com dimensões e morfologia típicas no título ou na diluição de trabalho dos anticorpos, tal como descrito no n.º 4.3.
4.4.5 – Interpretação do teste IF:
i) Se forem detectadas células fluorescentes brilhantes e com a morfologia característica, determinar o número médio de células típicas por cada campo do microscópio e calcular o número de células típicas por ml de sedimento ressuspenso (apêndice n.º 4);
Nota. – A leitura do teste IF revela um resultado positivo para amostras com, pelo menos, 5 x 10(elevado a 3) de células típicas por ml de sedimento ressuspenso. A amostra é considerada como potencialmente contaminada, sendo necessário efectuar outros testes.
ii) A leitura do teste IF revela um resultado negativo para amostras com menos de 5 x 10(elevado a 3) células por ml de sedimento ressuspenso, sendo a amostra considerada negativa.
Nota. – A realização de outros testes não é obrigatória.
5 – Teste FISH:
Princípio:
Sempre que se utilize o teste FISH como primeiro teste de rastreio e o seu resultado seja positivo, tem de se realizar o teste IF como segundo teste obrigatório de rastreio. Sempre que se utilize o teste FISH como segundo teste de rastreio e o seu resultado seja positivo, tem de se realizar mais testes de acordo com fluxograma para completar o diagnóstico.
Nota. – Utilizar sondas validadas específicas para C. m. subsp. sepedonicus (apêndice n.º 7). O teste preliminar com este método deve permitir a detecção reprodutível de, pelo menos, 10(elevado a 3)-10(elevado a 4) células de C. m. subsp. sepedonicus por ml adicionadas a extractos de amostras que anteriormente se tenham revelado negativos.
O procedimento seguinte deverá ser realizado, de preferência, com um extracto de amostra preparado na altura da utilização, mas pode também ser realizado com sucesso com um extracto de amostra que tenha sido armazenado em glicerol a uma temperatura compreendida entre 16 e 24°C ou 68 e 86°C.
Como controlos negativos, utilizar alíquotas de extracto de amostra que tenha anteriormente sido testado com resultado negativo para C. m. subsp sepedonicus.
Como controlos positivos preparar suspensões contendo 10(elevado a 5) a 10(elevado a 6) células de C. m. subsp. sepedonicus por ml provenientes de uma cultura com 3 a 5 dias (por exemplo, estirpe NCPPB 4053 ou PD 406) em tampão fosfato (PB) 0,01M (para a preparação ver apêndice n.º 2). Preparar lâminas de controlo positivo em separado com a estirpe homóloga, ou qualquer outra estirpe de referência de C. m. subsp. sepedonicus suspensa em extracto de batata, tal como especificado no apêndice n.º 2.
A utilização de sondas para eubactérias marcadas com FITC oferece um controlo para o processo de hibridação, visto que todas as eubactérias presentes na amostra ficarão coradas.
Testar o material de controlo de forma idêntica à da(s) amostra(s).
5.1 – Fixação do extracto de batata:
O protocolo seguinte tem por base Wullings et al.,(1998):
5.1.1 – Preparar a solução fixadora (ver apêndice n.º 7).
5.1.2 – Pipetar 100 (mi)l de cada extracto de amostra para um tubo Eppendorf e centrifugar durante 8 minutos a 7000 g.
5.1.3 – Remover o sobrenadante e dissolver o sedimento em 500(mi)l de fixador preparado há menos de 24 horas. Agitar em vortex e incubar até ao dia seguinte a 4°C.
Etanol a 96% constitui um fixador alternativo. Para o utilizar, dissolver o sedimento referido no n.º 5.1.2, em 50(mi)l de tampão fosfato 0,01M e 50(mi)l de etanol a 96%. Agitar em vortex e incubar a 4°C durante 30 a 60 minutos.
5.1.4 – Centrifugar durante 8 minutos a 7000 g, remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 75(mi)l de tampão fosfato 0,01M (ver apêndice n.º 3).
5.1.5 – Colocar 16(mi)l das suspensões fixadas numa lâmina multiteste limpa, tal como demonstrado na figura n.º 3. Aplicar duas amostras não diluídas diferentes por lâmina e utilizar 10(mi)l para obter uma diluição de 1:100 (em tampão fosfato 0,01M). A solução de amostra restante (49(mi)l) pode ser armazenada a 20°C após adição de 1 volume de etanol a 96%. Caso o teste FISH exija uma repetição, remover o etanol por centrifugação e adicionar igual volume de tampão fosfato 0,01M (agitar em vortex).
FIGURA N.º 3
Configuração para a lâmina FISH
(ver documento original)
5.1.6 – Secar as lâminas ao ar (ou num secador de lâminas a 37 C) e proceder à sua fixação à chama.
Nesta fase o procedimento pode ser interrompido e a hibridação continuada no dia seguinte. As lâminas devem ser armazenadas em local sem poeiras e seco à temperatura ambiente.
5.2 – Pré-hibridação e hibridação:
5.2.1 – Preparar uma solução de lisozima contendo 10 mg de lisozima (Sigma L-6876) em 10ml de tampão (Tris-HCl 100mM, EDTA 50 mM, pH 8,0). Esta solução pode ser armazenada mas deverá ser congelada/descongelada apenas uma vez. Cobrir cada poço de amostra com cerca de 50(mi)l de solução de lisozima e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente. Mergulhar então as lâminas em água desmineralizada apenas uma vez e secar com papel de filtro.
Alternativamente, em vez de lisozima, adicionar 50 (mi)l de uma solução de proteinas e K 40-400(mi)gml(elevado a -1) em tampão (Tris HCl 20mM, CaCl(índice 2) 2mM, pH 7,4) a cada poço e incubar a 37°C durante 30 minutos.
5.2.2 – Desidratar as células num gradiente de concentrações de etanol de 50%, 80% e 96% durante 1 minuto cada. Secar as lâminas ao ar num porta-lâminas.
5.2.3 – Preparar uma câmara de incubação húmida, cobrindo o fundo de uma caixa hermética com papel absorvente ou de filtro embebido em 1x «hybmix» (apêndice n.º 7). Pré-incubar a caixa na estufa de hibridação a 55°C durante, pelo menos, 10 minutos.
5.2.4 – Preparar 45(mi)l de solução de hibridação (apêndice n.º 7) por lâmina e pré-incubar durante 5 minutos a 55°C.
5.2.5 – Colocar as lâminas sobre uma placa aquecida a 45°C e aplicar 10(mi)l de solução de hibridação em cada um dos 4 poços da(s) lâmina(s).
5.2.6 – Aplicar duas lamelas (24 x 24 mm) em cada lâmina, sem retenção de ar. Colocar as lâminas na câmara húmida pré-aquecida e hibridar de um dia para o outro na estufa a 55°C, no escuro.
5.2.7 – Preparar 3 copos contendo 1 l de água ultra pura (UPW), 1 l de 1x «hybmix» (334 ml de 3 x «hybmix» e 666 ml de UPW) e 1 l de 1/2 x «hybmix» (167 ml de 3x «hybmix» e 833 ml de UPW). Pré-incubar cada um deles em banho-maria a 55°C.
5.2.8 – Retirar as lamelas das lâminas e colocar estas últimas no porta-lâminas.
5.2.9 – Remover as sondas em excesso por incubação durante 15 minutos no recipiente com 1x «hyb-mix» a 55°C.
5.2.10 – Transferir o porta-lâminas para uma solução de lavagem com 1/2 de «hybmix» e incubar durante mais 15 minutos.
5.2.11 – Mergulhar as lâminas brevemente em UPW e colocá-las sobre papel de filtro. Remover o excesso de humidade cobrindo a superfície suavemente com papel de filtro. Pipetar 5-10ìl de solução de montagem que evite uma rápida perda de fluorescência (por exemplo, Vectashield, Vector Laboratories, CA, USA ou equivalente) em cada poço e aplicar uma lamela grande (24 x 60 mm) cobrindo toda a lâmina.
5.3 – Leitura do teste FISH:
5.3.1 – Observar imediatamente as lâminas com um microscópio equipado para microscopia de epifluorescência, sob lente de imersão em óleo, a uma ampliação de 630 ou 1000x. Com um filtro indicado para isotiocianato de fluoresceína (FITC), as células eubacterianas (incluindo a maior parte das células gram-negativas) presentes na amostra mostram uma coloração verde fluorescente. Com um filtro para isotiocianato-5-tetrametilrodamina, as células de C. m. subsp. sepedonicus coradas com Cy3 revelam-se vermelho fluorescente. Comparar a morfologia das células com a dos controlos positivos. As células devem apresentar-se com uma fluorescência brilhante e completamente coradas. O teste FISH (n.º 9.4) deve ser repetido se a coloração for aberrante. Examinar os poços ao longo de dois diâmetros perpendiculares e à volta do perímetro. Para amostras que não revelem células, ou cujo número seja reduzido, observar, pelo menos, 40 campos do microscópio.
5.3.2 – Procurar células fluorescentes brilhantes com a morfologia característica de C. m. subsp. sepedonicus nos poços das lâminas de teste (ver sítio web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). A intensidade de fluorescência deve ser equivalente ou superior à da estirpe do controlo positivo. As células com coloração incompleta ou com fluorescência fraca não devem ser consideradas.
5.3.3 – Caso se suspeite de qualquer contaminação, o teste deve ser repetido. Este poderá ser o caso quando todas as lâminas de um lote revelem células positivas devido à contaminação do tampão ou se forem encontradas células positivas (fora do poço da lâmina) no revestimento da lâmina.
5.3.4 – Há vários problemas inerentes à especificidade do teste FISH. Em sedimentos de cones de hilos e de segmentos de caule da batateira, é provável a ocorrência de populações de células fluorescentes com morfologia atípica e reacções cruzadas de bactérias saprófitas com dimensões e morfologia semelhantes a C. m. subsp. sepedonicus, apesar de este fenómeno ser menos frequente do que no teste IF.
5.3.5 – Considerar unicamente as células fluorescentes de dimensões e morfologia típicas, ver n.º 5.3.2.
5.3.6 – Interpretação do resultado do teste FISH:
i) Obtêm-se resultados válidos para o teste FISH quando se observarem, com um filtro para FITC, células brilhantes com fluorescência verde de dimensões e morfologia típicas de C. m. subsp. sepedonicus e, com o filtro para rodamina, células brilhantes com fluorescência vermelha em todos os controlos positivos, as quais deverão estar ausentes em todos os controlos negativos. Se forem detectadas células fluorescentes brilhantes e com a morfologia característica, determinar o número médio de células típicas por cada campo do microscópio e calcular o número de células típicas por ml de sedimento ressuspenso (apêndice n.º 4). As amostras com, pelo menos, 5 x 10(elevado a 3) células típicas por ml de sedimento ressuspenso são consideradas como potencialmente contaminadas. A realização de outros testes é obrigatória. As amostras com menos de 5 x 10(elevado a 3) células típicas por ml de sedimento ressuspenso são consideradas negativas;
ii) O teste FISH é negativo se não se observarem, com um filtro para rodamina, células brilhantes com fluorescência vermelha e dimensões e morfologia típicas de C. m. subsp. sepedonicus, mas sejam observadas células típicas brilhantes com fluorescência vermelha nas preparações de controlo positivo mediante a utilização do filtro para rodamina.
6 – PCR:
Princípios:
Sempre que se utilize a PCR como teste de rastreio principal e o seu resultado seja positivo, tem de se realizar o teste IF como segundo teste obrigatório de rastreio. Sempre que se utilize o teste PCR como segundo teste de rastreio e o seu resultado seja positivo, tem de se realizar mais testes de acordo com o fluxograma para completar o diagnóstico.
A exploração completa deste método como teste de rastreio principal é apenas recomendada quando tenham sido adquiridos conhecimentos altamente especializados.
Nota. – Os testes preliminares com este método deveriam permitir a detecção reprodutível de 10(elevado a 3) a 10(elevado a 4) células de C. m. subsp. sepedonicus por ml adicionadas a amostras de extractos que apresentaram anteriormente resultados negativos. Poderão ser necessárias experiências de optimização para alcançar os níveis máximos de sensibilidade e especificidade em todos os laboratórios.
Utilizar reagentes e protocolos PCR validados. Seleccionar, de preferência, um método que disponha de um controlo interno.
Tomar as precauções necessárias para evitar a contaminação da amostra com ADN-alvo. O teste PCR deverá ser realizado por técnicos experimentados, em laboratórios dedicados à biologia molecular, no sentido de minimizar a possibilidade de contaminação com ADN-alvo.
Os controlos negativos (para os procedimentos de extracção de ADN e PCR) devem ser sempre manipulados como amostras finais no procedimento, a fim de evidenciar a ocorrência de qualquer contaminação com ADN.
Devem ser incluídos no teste PCR os seguintes controlos negativos:
Extracto de amostra que tenha anteriormente sido testado e se tenha revelado negativo relativamente à presença de C. m. subsp. sepedonicus;
Controlos dos tampões utilizados para extrair a bactéria e o ADN da amostra;
Mistura de reacção da PCR.
Devem ser incluídos os seguintes controlos positivos:
Alíquotas de sedimentos ressuspensos às quais se adicionou C. m. subsp. sepedonicus (ver preparação no apêndice n.º 2);
Uma suspensão em água contendo 10(elevado a 6) células por ml de um isolado virulento (por exemplo, NCPPB 2140 ou NCPPB 4053) de C. m. subsp. sepedonicus;
Se possível, utilizar também ADN extraído de amostras de controlo positivas no teste PCR.
Nota. – Para evitar uma potencial contaminação, os controlos positivos devem ser preparados num ambiente separado do das amostras a serem testadas.
Os extractos de amostras devem estar, o mais possível, isentas de terra. Seria, por isso, em alguns casos, mais prudente preparar as extracções a partir de batatas lavadas, caso se utilizem os testes PCR..
6.1 – Métodos de purificação do ADN:
Utilizar amostras de controlo positivo e negativo, tal como descrito anteriormente.
Preparar o material de controlo de forma idêntica à da(s) amostra(s).
Existe uma variedade de métodos para a purificação do ADN-alvo a partir de amostras de substratos complexos, removendo, deste modo, os inibidores da PCR e outras reacções enzimáticas e concentrando o ADN-alvo no extracto de amostra.
O método seguinte foi optimizado para utilização com o teste PCR validado, referido no apêndice n.º 6.
6.1 – a) Método segundo Pastrick (2000):
1) Pipetar 220(mi)l de tampão de lise (NaCl 100mM, Tris-HCl 10mM [pH 8,0], EDTA 1 mM [pH 8,0]) para um tubo Eppendorf de 1,5ml;
2) Adicionar 100(mi)l de extracto de amostra e colocar num bloco de aquecimento ou em banho-maria a 95°C durante 10 minutos;
3) Colocar o tubo em gelo durante 5 minutos,
4) Adicionar 80(mi)l de solução concentrada de lisozima (50 mg de lisozima por ml em Tris HCl 10mM,pH 8,0) e incubar a 37°C durante 30 minutos;
5) Adicionar 220 (mi)l de solução A Easy DNA(R) (Invitrogen), misturar bem em vórtice e incubar a 65°C durante 30 minutos;
6) Adicionar 100(mi)l de solução B Easy DNA(R) (Invitrogen), agitar vigorosamente em vortex até que o precipitado se desloque livremente no tubo e a amostra esteja uniformemente viscosa;
7) Adicionar 500(mi)l de clorofórmio e agitar em vortex até que a viscosidade diminua e a mistura se torne homogénea;
8) Centrifugar a 15000 g durante 20 minutos a 4°C para separar as fases e formar a interfase;
9) Transferir a fase superior para um tubo Eppendorf limpo,
10) Adicionar 1 ml de etanol a 100% (-20°C) agitar brevemente em vortex e incubar no gelo durante 10 minutos,
11) Centrifugar a 15000 g durante 20 minutos a 4°C e remover o etanol do sedimento;
12 ) Adicionar 500(mi)l de etanol a 80% (-20°C) e misturar invertendo o tubo;
13) Centrifugar a 15000 g durante 10 minutos a 4°C, guardar o sedimento e remover o etanol;
14) Deixar secar o sedimento ao ar ou em «DNA speed vac»;
15) Ressuspender o sedimento em 100(mi)l de UPW esterilizada e deixar à temperatura ambiente durante, pelo menos, 20 minutos;
16) Armazenar a -20°C até ser necessário para a realização da PCR;
17) Centrifugar qualquer precipitado branco até que este se deposite no fundo e utilizar 5(mi)l do sobrenadante contendo ADN para a PCR.
6.1 – b) Outros métodos:
Podem ser aplicados outros métodos de extracção de ADN (por exemplo, Qiagen DNeasy Plant Kit), desde que esteja provado que são igualmente eficazes na purificação do ADN a partir de amostras de controlo contendo 10(elevado a 3) a 10(elevado a 4) células do patogéneo por ml.
6.2 – PCR:
6.2.1 – Preparar as amostras a testar e controlos para a PCR em conformidade com o protocolo validado (apêndice n.º 6). Preparar uma diluição decimal de extracto de ADN da amostra (1:10 em UPW).
6.2.2 – Preparar a mistura adequada de reacção da PCR num ambiente isento de contaminação, de acordo com o protocolo publicado (apêndice n.º 6). O protocolo da PCR validado é uma reacção multiplex que incorpora também um controlo interno da PCR.
6.2.3 – Adicionar 5(mi)l de extracto de ADN à mistura de reacção da PCR de forma a obter um volume final de 25(mi)l em tubos PCR esterilizados.
6.2.4 – Incorporar uma amostra de controlo negativo contendo apenas a mistura de reacção da PCR e adicionar a mesma fonte de UPW utilizada na misturada PCR em substituição da amostra.
6.2.5 – Colocar os tubos no mesmo termociclador que foi utilizado no teste preliminar e iniciar o programa optimizado da PCR adequado (apêndice n.º 6).
6.3 – Análise do produto da PCR:
6.3.1 – Proceder à electroforese em gel de agarose dos fragmentos amplificados pela PCR. Correr, pelo menos, 12(mi)l de mistura de reacção contendo o ADN amplificado de cada uma das amostras, misturados com 3(mi)l de tampão de carregamento (apêndice n.º 6), em géis de agarose a 2% (p/v) em tampão de tris acetato-EDTA (TAE) (apêndice n.º 6) a 5-8 V por cm. Utilizar um marcador de ADN adequado, por exemplo 100bp DNA ladder.
6.3.2 – Revelar as bandas de ADN através de coloração em brometo de etídio (0,5mg por l) durante 30-45 minutos, tomando as precauções adequadas para manusear este agente mutagénico.
6.3.3 – Observar o gel corado num transiluminador com UV de ondas curtas (por exemplo, (lambda) = 302 nm) para detecção de produtos amplificados da PCR de tamanho esperado (apêndice n.º 6) e documentar.
6.3.4 – Para todas as novas detecções/situações, verificar a autenticidade do fragmento amplificado pela PCR através da realização de análise de restrição enzimática na amostra do ADN amplificado restante, por incubação com uma enzima de restrição e um tampão adequados à temperatura e com duração óptimas (apêndice n.º 6). Proceder em seguida, tal como anteriormente, à electroforese em gel de agarose dos fragmentos digeridos e observar o padrão dos fragmentos de restrição característico num transiluminador com UV, após coloração com brometo de etídio, e comparar com o controlo positivo não digerido e digerido.
Interpretação do resultado do teste PCR:
O teste PCR é considerado negativo caso não seja detectado o fragmento amplificado pela PCR de tamanho específico esperado para C. m. subsp. sepedonicus para a amostra em estudo, mas seja detectado em todas as amostras de controlo positivo (no caso da PCR multiplex com iniciadores de controlo interno específicos para as plantas, deverá ser detectado um segundo produto da PCR de tamanho esperado na amostra em estudo).O teste PCR é considerado positivo caso seja detectado o fragmento amplificado pela PCR específico para C. m. subsp. sepedonicus de tamanho e padrão de restrição esperados (quando necessário), desde que não seja amplificado a partir de nenhuma das amostras de controlo negativo. A confirmação fiável de um resultado positivo pode também ser obtida mediante a repetição do teste com um segundo conjunto de iniciadores da PCR (n.º 9.3).
Nota. – Pode suspeitar-se de inibição da PCR se o fragmento amplificado esperado for observado na amostra de controlo positivo de uma suspensão aquosa de C. m. subsp. sepedonicus, mas se obtenham resultados negativos de controlos positivos de C. m. subsp. sepedonicus em extracto de batata. Nos protocolos da PCR multiplex com controlos internos da PCR, a inibição da reacção é indicada sempre que não se obtenha nenhum dos dois fragmentos amplificados.
Pode suspeitar-se de contaminação, caso o fragmento amplificado esperado seja obtido em um ou vários dos controlos negativos.
7 – Bioensaio:
Nota. – Um teste preliminar com este método deve permitir a detecção reprodutível de 10(elevado a 3) a 10(elevado a 4) unidades formadoras de colónias de C. m. subsp. sepedonicus por ml adicionadas a amostras de extractos para os quais se obtiveram anteriormente resultados negativos (para a preparação ver apêndice n.º 2).
A mais elevada sensibilidade de detecção pode ser esperada quando se utiliza uma amostra de extracto recentemente preparada e condições de crescimento óptimas. No entanto, o método pode ser aplicado com sucesso a extractos que tenham sido armazenados em glicerol a uma temperatura compreendida entre 68 e 86°C.
Algumas variedades de beringelas constituem um excelente meio de enriquecimento selectivo para o crescimento de C. m. subsp. sepedonicus, mesmo na ausência de sintomas, proporcionando também um excelente teste de patogenicidade para confirmação da identificação da bactéria.
As condições de cultivo devem ser óptimas para reduzir o risco de falsos resultados negativos.
Para os pormenores das condições de cultivo, ver apêndice n.º 8.
7.1 – Distribuir toda a alíquota restante do sedimento ressuspenso, descrito nos n.os 3.1.6 ou 3.2.5, pelas beringelas através de um dos métodos a seguir referidos (n.º 7.3 ou 7.4). Utilizar apenas plantas que se encontrem no estado fenológico de 2-3 folhas, até à expansão total da terceira folha verdadeira. De forma a assegurar a completa utilização do sedimento ressuspenso bem como uma inoculação eficaz, os procedimentos a seguir mencionados irão requerer a inoculação de 15-25 plantas de beringela por amostra.
7.2 – Não regar as beringelas 1 a 2 dias antes da inoculação para reduzir a sua turgescência.
7.3 – Inoculação por fenda:
7.3.1 – Segurar a planta entre dois dedos, pipetar uma gota (cerca de 5-10(mi)l) do sedimento ressuspenso no caule, entre os cotilédones e a primeira folha.
7.3.2 – Utilizando um escalpelo esterilizado, fazer uma fenda em diagonal com 1,0 cm de comprimento e com uma profundidade de cerca de 2/3 do diâmetro do caule, começando a incisão a partir da gota desedimento.
7.3.3 – Selar o corte com vaselina esterilizada aplicada com uma seringa.
7.4 – Inoculação por injecção:
Inocular os caules das beringelas imediatamente acima dos cotilédones, utilizando uma seringa comum a agulha hipodérmica (não inferior a 23 G). Distribuir o sedimento pelas beringelas.
7.5 – Como controlos positivos, inocular 5 plantas com uma suspensão aquosa de 10(elevado a 5) a 10(elevado